Приобретенная апластическая анемия, симптомы и лечение. Пароксизмальная ночная гемоглобинурия (болезнь Маркьяфавы-Микели) Что делать если анализы на пнг положительные

Владельцы патента RU 2574968:

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для диагностики пароксизмальной ночной гемоглобинурии. Для этого окрашивают исследуемый образец крови моноклональными антителами CD235a (FITC)/ CD59(PE)/CD71 (АРС). Наличие ПНГ-клона среди эритроцитов и ретикулоцитов оценивают по отсутствию защитного белка CD59 на мембране ретикулоцитов, выделенных по гейту CD235a - панэритроцитарному маркеру и CD71- рецептору к трансферрину. Для оценки ПНГ-клона среди ретикулоцитов в гейте CD71+ собирают не менее 20000 событий, в зависимости от гейта CD71+ строят график FSC(log) vs SSC(log), на котором с помощью дополнительного гейта CD71str выделяют ретикулоциты, очищая таким образом популяцию ретикулоцитов от дебриса и дуплетов методом последовательного гейтирования. При наличии 100% положительных по CD59 ретикулоцитов судят об отсутствии ПНГ-клона и диагностируют отсутствие заболевания пароксизмальной ночной гемоглобинурии. При выявлении у пациента с клиническими симптомами негативных CD59- ретикулоцитов и значении полученных показателей более 1% дают диагностическое заключение о наличии ПНГ-клона и для подтверждения диагностики пароксизмальной ночной гемоглобинурии рекомендуют дополнительное исследование по международному стандартизованному протоколу. При выявлении негативных по CD59-ретикулоцитов и значении полученных показателей 0,1-1% судят о наличии минорного ПНГ-клона и рекомендуют повторное определение ПНГ-клона через 6 мес на предмет увеличения его значения и развития пароксизмальной ночной гемоглобинурии, и при подтверждении такого размера клона диагностируют субклиническую форму пароксизмальной ночной гемоглобинурии без клинических признаков. Использование многопараметрического гейтирования CD71+ клеток позволяет добиться исключения из анализа дебриса, дублетов и от неспецифически связавшихся моноклональных антител. 1 ил.

Изобретение относится к области медицины, а именно клинико-лабораторным методам диагностики, и может быть использовано для скрининг-диагностики пароксизмальной ночной гемоглобинурии (ПНГ).

Пароксизмальная ночная гемоглобинурия относится к редким заболеваниям.

ПНГ возникает вследствие мутации PIG-A гена. В результате этого нарушается синтез гликозилфосфатидилиннозитолового (GPI) якоря, осуществляющего фиксацию многочисленных молекул на мембране клеток крови (в том числе CD24 на гранулоцитах, CD14 на моноцитах, CD59 на эритроцитах и их предшественниках), которые защищают клетки крови от воздействия системы комплемента.

Мембрана эритроцитов в наибольшей степени подвержена воздействию мембран атакующего комплекса, и в отсутствие защитного белка CD59 эритроциты подвергаются гемолизу.

Для ПНГ характерны внутрисосудистый гемолиз, анемия, гемоглобинурия, тромботические осложнения, дисфагия, вялость, эректильная дисфункция, хроническая почечная недостаточность, легочная гипертензия.

Помимо этого ПНГ-клон может возникать при апластической анемии, аутоиммунной гемолитической анемии и миелодиспластическом синдроме. Возрастная медиана возникновения ПНГ - 30-35 лет. Заболеваемость пароксизмальной ночной гемоглобинурией от 1 до 10:1 млн человек. Смертность без лечения при пароксизмальной ночной гемоглобинурии составляет около 35% в течение 5 лет от начала заболевания.

В настоящее время появились клеточные технологии, позволившие разработать современные методы лечения этого заболевания.

В связи с этим возникла необходимость создания точных методов диагностики, т.к. эффективность и адекватность лечения зависит от информативности, объективности и доказательности диагностических мероприятий, и полноты полученной информации, позволяющей оценить наличие ПНГ-клона и уточнить постановку диагноза.

Известен способ выявления ПНГ по методу Хема для диагностики пароксизмальной ночной гемоглобинурии (Абдулкадыров К.М., Клиническая гематология, Справочник - СПб.: Питер, 2006, с. 82), основанный на стимуляции инактивации системы комплемента в результате подкисления образца крови и повышенной чувствительности к нему эритроцитов больных пароксизмальной ночной гемоглобинурией. Результат пробы Хема оценивается визуально.

Способ заключается в том, что к сыворотке крови донора, сопоставимой с сывороткой больного по АВО-системе антигенов, добавляется 0,2 нормальный раствор HCl, изменятся ее рН сыворотки до 6,4 и тем самым вызывается активация комплемента (соотношение сыворотки и кислоты 9:1). Далее десять объемов подкисленной сыворотки смешивают с одним объемом 50% суспензии отмытых эритроцитов. Затем производят визуальную оценку получившейся суспензии. При пароксизмальной ночной гемоглобинурии наступает гемолиз эритроцитов и суспензия приобретает красноватую либо красную окраску, в то время как нормальные эритроциты в этих же условиях не гемолизируются.

Однако методика не обладает достаточной чувствительностью для определения минорных клонов ПНГ: минимально определяемый размер клона - 4,2-5%. Метод Хема не дает информации о размере клона.

Все это не дает возможности оценить ПНГ-клон в процентах, что при обнаружении заболевания при скрининге является отправной точкой для последующего мониторинга и адекватного лечения.

Кроме того, методика является весьма трудоемкой, не отвечает современным требованиям к диагностике.

Известен также способ диагностики пароксизмальной ночной гемоглобинурии с использованием сахарозного теста («Проблемы гематологии и переливания крови», 1972, август, 17(8)55-7, «Оценка сахарозного теста для диагностики пароксизмальной ночной гемоглобинурии», Идельсон Л.И., Бенисович В.И., Савина Л.С., Радживиловская Е.Г.).

Способ основан на повышенной чувствительности эритроцитов больного пароксизмальной ночной гемоглобинурией к белкам системы комплемента, в данном случае за счет добавления сахарозы.

К эритроцитам больного добавляется свежая сыворотка донора, идентичная по группе крови больного. Эритроциты трижды отмываются в физиологическом растворе (0,145 М NaCl), 100 мкл цитратной или дефибринированной крови добавляется к 900 мл сахарозного раствора и производится инкубация 30 минут при 37°C или 23°C. После этого пробирки центрифугируются, затем супернатант оценивается на предмет видимого гемолиза. Если гемолиз наступает, его степень, выраженная в процентах, высчитывается из концентрации гемоглобина супернатанта, которая определяется цианметгемоглобиновым методом.

Образцы цельной крови смешиваются в пропорции 9:1 с 3,2% цитратом натрия или 0,1М раствором оксалата, цельная кровь дефибринируется путем добавления 4-миллиметрового стеклянного шарика на 2 мл крови. Аликвоты цельной крови и плазмы, свободной от тромбоцитов, смешиваются в различных пропорциях. Изотонический раствор сахарозы подготавливается растворением 0,27 моль специального реагента сахарозы в 91 мл 50 мМ NaH 2 PO 4 и 9 мл NaHPO 4 . рН при необходимости доводится до 6,1 небольшими концентрациями NaOH. В финальный объем заливается 1000 мл воды.

Пробирки центрифугируются, и супернатант оценивается на предмет видимого гемолиза. Процент гемолиза - расчетная величина, высчитывается из концентрации гемоглобина супернатанта, определяемой цианметгемоглобиновым методом. Готовят также две другие аликвоты - 100% гемолиз и «нулевой» гемолиз (без эритроцитов) для оценки образца.

Недостатком способа является недостаточная чувствительность и специфичность для диагностики заболевания: минимально определяемый размер клона - 4,2-5% не дает точного представления о размере клона, в то время как он может присутствовать в крови больного при меньших значениях - менее 4,2%. К недостаткам способа можно также отнести его трудоемкость.

Известен также способ диагностики ПНГ-клона (Rosse WF. Variations in the red cells in paroxysmal nocturnal haemoglobinuria. Br J Haematol 1973; 24:327-42. 12), включающий измерение и анализ степени гемолиза при различных концентрациях комплемента. Этот анализ показывает, что ПНГ-клетки лизируются при более низких концентрациях, чем нормальные клетки.

При помощи данного теста определяют популяции клеток с промежуточной чувствительностью к белкам системы комплемента (тип II) между нормальными эритроцитами (тип I) и патологическими эритроцитами при пароксизмальной ночной гемоглобинурии (тип III). Однако способ является трудоемким и трудно стандартизируемым. При использовании теста можно пропустить небольшие популяции аномальных клеток.

Известен способ выделения ретикулоцитов по CD71 для определения ПНГ-клона методом проточной цитометрии среди ретикулоцитов и гранулоцитов (Tsagarakis NJ, Paterakis G. Asimple flow cytometric assay for routine paroxysmal nocturnal hemoglobinuria testing based on immature reticulocytes and granulocytes. - ClinicalCytometry, 07.2012. - C. 259-263) (http://onlinelibrary.wiley.coni/doi/10.1002/cyto.b.21030/full).

Исследуется цельная кровь пациента, которую разводят в фосфатно-солевом буфере 1:100. В две пробирки вносят по 50 мкл разведенной крови, затем производится окрашивание: в первой пробирке 10 мкл моноклональных антител (МКА) к CD71 и 20 мкл МКА к CD59; во вторую пробирку вносится 10 мкл изотипического контроля IgGl. Оценка результатов производится на однопараметрических гистограммах.

Кроме того, в методике анализируются также гранулоциты, используя комбинации МКА: 1) CD59-FITC /CD24-PE /CD45-PE-Cy5/; 2) CD66b-FITC /CD16-PE /CD45-PE-Cy5.

Согласно данному методу чувствительность определения ПНГ-клона среди гранулоцитов составляет 1%, чувствительность определения ПНГ-клона среди ретикулоцитов - 5%. Однако предложенный метод протестирован на небольшом количестве пациентов с пароксизмальной ночной гемоглобинурией (n=8) и с ПНГ-клоном менее 1% (при его оценке на гранулоцитах, и, соответственно, менее 5% при определении на ретикулоцитах) (n=7). Также чувствительность определения клона на ретикулоцитах (5%) не позволяет использовать методику для одновременной оценки клона среди гранулоцитов и ретикулоцитов. При этом среди образцов крови пациентов с подозрением на ПНГ не было таковых с размером клона 1-24%, что не дает полной картины о корреляции значений в этом диапазоне. При таком подходе затруднено гейтирование ретикулоцитов из-за отсутствия в панели панэритроцитарного маркера (CD235a), что особенно необходимо для выделения чистой популяции и отсечки дебриса и дуплетов. Кроме того, для объективной оценки ПНГ-клона необходимо оценивать десятки тысяч клеток. На один тест по предложенному способу затрачивается большое количество антител. Общее количество собранных событий по гейту (по CD71) (2000 событий) может оказаться недостаточным для выявления клона.

Таким образом, известный способ был протестирован на небольшом количестве пациентов с пароксизмальной ночной гемоглобинурией и ПНГ-клоном, клетки, неспецифически связавшиеся с МКА к CD71, вероятнее всего, будут искажать результаты анализа. Кроме того, для данного анализа используются 6 видов моноклональных антител, 2 из них используются дважды, что отражается на высокой стоимости используемой панели МКА. Способ был испытан на 8 пациентах с ПНГ, 7 из них имели значение клона ниже порога чувствительности (1% для гранулоцитов, 5% для ретикулоцитов). Этот способ не решает задачи достоверного выявления минорных ПНГ-клонов и не является доказательным высокой чувствительности метода.

В качестве ближайшего аналога известен способ диагностики пароксизмальной ночной гемоглобинурии методом проточной цитометрии, предложенный международной ассоциацией клинической цитометрии (ICCS). (Michael J. Borowitz, Fiona E. Craig, Joseph A. DiGiuseppe, Andrea J. Illingworth, Wendell Rosse, D. Robert Sutherland, Carl T. Wittwer, Stephen J. Richards. Guidelines for the diagnosis and monitoring of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria and related disorders by flow cytometry, онлайн: 28 APR 2010.DOI:10.1002/cyto.b.20525).

Способ включает исследование наличия GPI-связанных белков на гранулоцитах, моноцитах и эритроцитах. Исследование состоит из двух этапов: подготовка образцов и последующий анализ на проточном цитометре.

Для анализа эритроцитов цельная кровь разводится фосфатно-солевым буфером в соотношении 1:100, 10 мкл цельной крови вносятся в 990 мкл фосфатно-солевого буфера; Далее в промаркированную пробирку добавляется 40 мкл полученной клеточной суспензии. Для окрашивания эритроцитов к клеточной суспензии добавляются моноклональные антитела, конъюгированные с флуорохромами CD235FITC-меченый и CD59 меченый РЕ соответственно. После инкубации с моноклональными антителами 30 минут в темноте производится отмывка образцов от несвязавшихся моноклональных антител. Для анализа эритроцитов отмывание производится дважды путем центрифугирования образца в 4 мл фосфатно-солевого буфера при 1500 об 5 минут, далее отбирается супернатант, клетки ресуспендируются, добавляется 500 мкл фосфатно-солевого буфера для проведения дальнейшего анализа.

Для сбора и анализа эритроцитов на проточном цитометре при помощи программного обеспечения прибора строятся графики:

График-FS(log) vs (против) SS(log), на котором выделяется популяция эритроцитов (создают гейт RBC) и отсеиваются дебрис, тромбоциты и агрегаты эритроцитов;

На графике CD235a(log) vs FS(log) отражаются события из гейта RBC для более четкого выделения популяции эритроцитов, позитивной по маркеру CD235a популяции эритроцитов, создают новый гейт (CD235a+)

CD59(log) vs CD235a, (на гистограмме показываются события, гейтированные по CD235a+). На гистограмме отражается уровень экспрессии CD59 на эритроцитах. Клетки без дефицита CD59 - I тип это нормальные эритроциты, клетки с частичным дефицитом экспрессии CD59 - ПНГ-клон II типа, клетки, неэкпрессирующие CD59, то есть эритроциты с полным дефицитом CD59 - это ПНГ-клон III типа.

Согласно методике собирается не менее 50000 цитометрических событий.

Для подготовки к анализу гранулоцитов и моноцитов в две промаркированные пробирки добавляют по 100 мкл периферической крови. Далее для окрашивания мечеными моноклональными антителами в каждую пробирку добавляют свою комбинацию меченых моноклональных антител:

комбинацию меченых моноклональных антител для определения ПНГ-клона среди гранулоцитов FLAER(AlexaFluor700) /CD15(PE)/CD24(PerCP)/CD45(PE-Cy7) (гейтирующие маркеры: CD45 и CD15, GPI - связанные маркеры FLAER и CD24);

комбинацию меченых моноклональных антител для определения ПНГ-клона среди моноцитов FLAER(AlexaFluor700) /CD14PE/CD64PerCP/CD45PE-Cy7, где гейтирующие маркеры: CD45 и CD64, GPI - связанные маркеры FLAER и CD14;

Окрашенные образцы инкубируются 30 минут при комнатной температуре в темноте, после чего для избавления от эритроцитов к образцу добавляется 1 мл лизирующего раствора. После инкубации с лизирующим раствором образцы центрифугируются 5 мин при 1500 оборотов, после центрифугирования сливается супернатант, лейкоциты на дне пробирки ресуспендируются. Далее производится отмывка образцов от лизирующего раствора путем добавления к пробе 2 мл фосфатно-солевого буфера и последующего центрифугирования 5 минут при 1500 оборотов. После центрифугирования супернатант сливается, клетки ресуспендируются, далее добавляется 500 мкл фосфатно-солевого буфера для проведения дальнейшего анализа.

Для анализа и сбора гранулоцитов и моноцитов на проточном цитометре при помощи программного обеспечения прибора строятся следующие графики:

На графике CD45(log) vs SS, выделяются области лимфоцитов CD45+LY (клетки области высокой экспрессии CD45, низких значений SS), моноцитов СD45+MON (клетки области средней экспрессии CD45, более высоких значений SS) и гранулоцитов CD45+GRAN (клетки области невысокой экспрессии CD45, высоких значений SS).

Для анализа ПНГ-клона среди гранулоцитов строится график CD 15 (log) vs SS в зависимости от гейта (CD45+GRAN). С помощью гейта CD15+ выделяется популяция гранулоцитов без дебриса и клеток, не связавшихся с моноклональными антителами к CD15;

Гистограмма FLAER(log) vs CD24(log) (строится в зависимости то гейта CD15+. На данном графике строится гейт PNH GRAN, захватывающий зону, негативную по экспрессии CD24 и FLAER. Отсутствие этих маркеров на гранулоцитах указывает на принадлежность клеток к ПНГ-клону.

Для оценки ПНГ-клона среди моноцитов строится график -CD64(log) vs SS в зависимости от гейта CD45 MON. На этом графике С064-позитивные события ограничиваются гейтом CD64+MON. В зависимости от гейта CD64+MON строится график -FLAER(log) vs CD14(log) (в зависимости от выделенной популяции моноцитов CD64+ - гейта). На данном графике строится гейт PNH MON, захватывающий зону, негативную по экспрессии CD14 и FLAER. Отсутствие этих маркеров на моноцитах указывает на принадлежность клеток к ПНГ-клону.

Значение ПНГ-клона - это процент клеток (гранулоцитов, моноцитов, эритроцитов), среди которых наблюдается отсутствие GPI-связанных якорных белков.

Исследование ПНГ-клона согласно международному протоколу является «золотым стандартом» в диагностике ПНГ. Однако исследование является дорогостоящим и трудоемким. На подготовку и проведение анализа согласно данному способу затрачивается не менее 2,5-3 часов.

В связи с тем, что ПНГ относится к редким заболеваниям, по разным данным им страдают от 1 до 10 человек на 1 миллион населения, большая часть пациентов, направленных для диагностики ПНГ-клона, не будет являться ПНГ позитивными. Следовательно, трудоемкий и дорогостоящий анализ согласно международному протоколу пациентам с отсутствием ПНГ делать нецелесообразно, а достаточно только ответить на вопрос, присутствует ПНГ-клон или нет. При стоимости меченых моноклональных антител от 500 у.е. за одно наименование полный набор антител и реагентов для диагностики ПНГ согласно международному подходу будет стоить от 5000 у.е. Учитывая короткий срок годности для некоторых из требующихся реагентов, даже в городе с населением в 1 миллион человек с помощью одного набора в год могут быть обследованы от 10 до 100 пациентов, соответственно, себестоимость одного исследования может доходить до 500 у.е.

Задачей изобретения является создание точного, чувствительного и доказательного способа лабораторной диагностики пароксизмальной ночной гемоглобинурии, обладающего простотой исполнения, доступностью и позволяющего проводить скрининг пароксизмальной ночной гемоглобинурии с минимальными материальными затратами.

Сущность изобретения состоит в том, что в способе лабораторной диагностики пароксизмальной ночной гемоглобинурии, включающем окрашивание цельной крови пациента моноклональными антителами в фосфатно-солевом буфере, инкубирование, отмывку клеток крови от несвязавшихся моноклональных антител путем центрифугирования, ресуспендирование готового образца, последующее проведение оценки размера клона или его отсутствия в программе проточного цитометра по отсутствию или наличию защитных белков, для окрашивания исследуемого образца крови используют трехцветную комбинацию моноклональных антител CD235a (FITC)/CD59(PE)/CD71 (АРС), которые добавляют в пробирку с образцом, наличие ПНГ-клона среди эритроцитов и ретикулоцитов оценивают по отсутствию защитного белка CD59 на мембране ретикулоцитов, выделенных по гейту CD235a - панэритроцитарному маркеру и CD71-рецептору к трансферрину, для оценки ПНГ-клона среди ретикулоцитов в гейте CD71+ собирают не менее 20000 событий, в зависимости от гейта CD71+ строят график FSC(log) vs SSC(log), на котором с помощью дополнительного гейта CD71str выделяют ретикулоциты, очищая таким образом популяцию ретикулоцитов от дебриса и дуплетов методом последовательного гейтирования, полученные значения показателей сравнивают с критериями нормы, и при наличии 100% положительных по CD59 ретикулоцитов судят об отсутствии ПНГ-клона и диагностируют отсутствие заболевания пароксизмальной ночной гемоглобинурии. При выявлении у пациента с клиническими симптомами негативных CD59-ретикулоцитов и значении полученных показателей более 1% дают диагностическое заключение о наличии ПНГ-клона и для подтверждения диагностики пароксизмальной ночной гемоглобинурии рекомендуют дополнительное исследование по международному стандартизованному протоколу, при выявлении негативных по CD59-ретикулоцитов и значении полученных показателей 0,1-1% судят о наличии минорного ПНГ-клона и рекомендуют повторное определение ПНГ-клона через 6 мес на предмет увеличения его значения и развития пароксизмальной ночной гемоглобинурии, при подтверждении такого размера клона диагностируют субклиническую форму пароксизмальной ночной гемоглобинурии без клинических признаков.

Использование изобретения позволяет получить следующий технический результат.

Предлагаемый способ выявления ПНГ-клона обладает высокой достоверностью, точностью и чувствительностью - 0,1%, сопоставимой с международной стандартизированной методикой, и является доказательным.

Он позволяет определить наличие ПНГ-клонов как значительного размера у пациентов с истинной пароксизмальной ночной гемоглобинурией, так и минорных - от 0,01 до 1%, у пациентов с апластической анемией и при миелодиспластическом синдроме.

Способ является более простым в выполнении, не требует больших материальных затрат по сравнению с международной стандартизированной методикой.

Технология определения ПНГ-клона дает возможность использовать минимальное количество (три) моноклональных антитела при скрининге ПНГ (CD235a, CD71, CD59).

Для исследования крови одного пациента используют только одну пробирку, что также упрощает и ускоряет проведение анализа.

Затраты времени на проведение одного теста составляют 40-50 минут. Использование меньшего количества антител без применения лизирующих растворов делает анализ дешевле примерно на 75% за одно исследование. При этом сохраняется высокая чувствительность и точность диагностики.

В большинстве случаев способ позволяет избежать дополнительных затрат, связанных с применением большего количества антител, поскольку, в виду редкой встречаемости заболевания, часто результат оказывается отрицательным. Методика хорошо подходит для скрининга пациентов и является доступной для медицинских учреждений разного профиля, а также для всех категорий граждан.

Конечный результат анализа в предлагаемом способе представляется в виде процента эритроцитов и ретикулоцитов с дефектом GPI-связанных белков, то есть ПНГ-клон. Методика дает возможность определить повышенный риск тромбообразования, исходя из процента выявленного ПНГ-клона.

Предлагаемый способ является предпочтительным в сравнении с некоторыми другими известными методами - пробой Хема, сахарозным тестом, измерением степени гемолиза при различных концентрациях белков системы комплемента.

Технический результат достигается за счет разработанной авторами новой технологии определения ПНГ-клона при пароксизмальной ночной гемоглобинурии при помощи проточной цитометрии, алгоритм которой предусматривает определение данного клона на ретикулоцитах и эритроцитах (в отличие от стандартно определяемого на нейтрофилах, моноцитах и эритроцитах). При этом авторы впервые используют комбинацию антител CD235a(FITC)/CD59 (PE)/CD71(APC). Согласно предлагаемому методу в момент анализа данных используют дополнительную процедуру многопараметрического гейтирования CD71+ клеток и исключения из анализа дебриса, дублетов и избавления от неспецифически-связавшихся моноклональных антител.

Ключевым моментом является проведение исследования ретикулоцитов, которые по разработанной авторами технологии выделяются с использованием антител к CD71 и исследуются при помощи подобранной авторами комбинации трех моноклональных антител CD235a(FITC)/CD59(PE)/CD71(APC). ПНГ-клон среди ретикулоцитов отражает истинное значение ПНГ-клона, авторами проведено сравнение полученных значений ПНГ-клонов среди ретикулоцитов со значениями, полученными при помощи стандартизированного международного подхода к диагностике ПНГ. Корреляция объема ПНГ-позитивных ретикулоцитов с моноцитами составляет 0,95, с гранулоцитами - 0,93. Процент ПНГ-позитивных эритроцитов согласно предлагаемой методике, измеряется с более высокой чувствительностью, по сравнению с международным стандартизованным подходом, т.к. с помощью предлагаемого метода исследуются не менее 1000000 эритроцитов, а согласно ICCS только 500000.

Впервые проведено исследование ПНГ-клона на ретикулоцитах с использованием комбинации моноклональных антител CD235a/CD71/CD59, позволившей оценить размер этого клона с чувствительностью 100%.

В результате появилась возможность при использовании трех моноклональных антител проводить скрининг ПНГ. Использование дополнительного этапа выделения ретикулоцитов и «отсечения» неспецифически связавшихся с моноклональными антителами клеток (на графике FS vs SS, рис.) дают точный результат, что позволяет на основании скрининга подтвердить диагноз ПНГ и провести эффективное адекватное лечение.

Способ осуществляется следующим образом.

Для проведения исследования венозную кровь пациента берут в пробирку с антикоагулянтом K 2 EDTA. Пробирка доставляется в лабораторию из процедурного кабинета лечебно-профилактического учреждения (ЛПУ).

Для анализа эритроцитов и ретикулоцитов цельную кровь разводят в отдельной полистирольной пробирке. Для разведения фосфатно-солевым буфером в соотношении 1:10 50 мкл цельной крови вносят в 450 мкл фосфатно-солевого буфера и тщательно перемешивают в течение 5 сек на вортексе, далее 40 мкл полученной клеточной суспензии вносят в промаркированную пробирку.

Для окрашивания образца применяют трехцветную комбинацию моноклональных антител - CD235a(FITC)/CD59(PE)/CD71(APC). Окрашивание производят путем внесения в образец последовательно по 3 мкл меченых моноклональных антител, после чего пробирку встряхивают в течение 5 сек на вортексе. Далее производят инкубацию в течение 15 минут в темноте при комнатной температуре.

Затем клетки крови отмывают дважды в 4 мл фосфатно-солевого буфера в режиме центрифугирования в течение 5 мин с частотой 1500 об/мин. После каждого центрифугирования с помощью пипетки аккуратно собирают супернатант таким образом, чтобы клетки остались на дне пробирки.

Готовый образец ресуспендируют 5 секунд на вортексе и добавляют 750 мкл фосфатно-солевого буфера, после чего образец готов для исследования на проточном цитометре.

Далее проводят оценку и учет результатов с использованием многоцветной проточной цитометрии. Анализ возможно проводить на любых проточных цитометрах, оснащенных детекторами не менее чем для трех флюоресцентных каналов.

Измерения проводят на проточном цитометре BD FACSCanto™ II Becton-Dickinson (США).

Оценку наличия или отсутствия ПНГ-клона на эритроцитах и ретикулоцитах, а также размер ПНГ-клона осуществляют на проточном цитометре, используя специальное программное обеспечение.

Для оценки ПНГ-клона среди эритроцитов и ретикулоцитов строят график - FSC(log) vs SSC(log), с помощью логического ограничения выделяют область эритроцитов, исключая дебрис и дуплеты (фиг. 1а).

Затем на графике FSC(log) vs CD235a (фиг. 1b) строят гейт CD235a+, тем самым ограничивая позитивные клетки и исключая события, неспецифически связавшиеся с CD235a (дебрис и клетки, не относящиеся к популяции CD235a+).

События, вошедшие в гейт CD235a+, анализируют на графике CD71 vs FSC(log) (фиг. 1е), на нем выделяется популяция, позитивная по CD71.

Для объективной оценки ПНГ-клона среди ретикулоцитов в гейте CD71+ собирают не менее 20000 событий.

В зависимости от гейта CD71+ строят график FSC(log) vs SSC(log) (фиг. 1f), на котором при помощи дополнительного гейта CD71str выделяют ретикулоциты и таким образом, популяцию окончательно очищают от дебриса и дуплетов методом последовательного гейтирования.

Далее строится график CD235a vs CD59 (фиг. 1g) в зависимости от гейта CD71str (выделенные ретикулоциты). На этом графике выделяют две области Norm°Ret и PNH°Ret (фиг. 1g), это границы нормальных и ПНГ-позитивных ретикулоцитов соответственно. Статистические данные отражают в абсолютных значениях и % от гейта (фиг. 1d и 1h).

Протоколы сбора данных настраивают один раз, в последующем необходима лишь небольшая корректировка.

Гейт CD235a+ на первом этапе сбора данных является стоп-гейтом, т.е. в нем собирают 1000000 событий. Гейт CD235a+ применяют к графику CD235a vs CD59 (фиг. 1с). Если в регионах PNH Type II и PNH Type III на графике CD235a vs CD59 суммарно оказывается не более 10 событий, сбор данных прекращают и делают вывод об отсутствии ПНГ-клона.

При большем количестве событий суммарно в этих регионах исследование продолжают.

ПНГ-клон среди ретикулоцитов - это выраженное в процентах количество ретикулоцитов, на которых отсутствует защитный белок CD59.

При наличии 100% положительных по CD59 ретикулоцитов судят об отсутствии ПНГ-клона и диагностируют отсутствие заболевания пароксизмальной ночной гемоглобинурии.

При выявлении у пациента с клиническими симптомами негативных CD59-ретикулоцитов и значении полученных показателей более 1% дают лиагностическое заключение о наличии ПНГ-клона и для подтверждения диагностики пароксизмальной ночной гемоглобинурии рекомендуют дополнительное исследование по международному стандартизованному протоколу (Michael J. Borowitz, Fiona E. Craig, Joseph A. DiGiuseppe, Andrea J. Illingworth, Wendell Rosse, D. Robert Sutherland, Carl T. Wittwer, Stephen J. Richards. Guidelines for the diagnosis and monitoring of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria and related disorders by flow cytometry).

При выявлении негативных no CD59-ретикулоцитов и значении полученных показателей 0,1-1% судят о наличии минорного ПНГ-клона. В этом случае рекомендуется повторное определение ПНГ-клона через 6 мес на предмет увеличения его значения и развития пароксизмальной ночной гемоглобинурии.

При подтверждении такого размера клона методом проточной цитометрии согласно международному протоколу диагностируют субклиническую форму пароксизмальной ночной гемоглобинурии без клинических признаков или судят о ПНГ-клоне, сопутствующем АА и МДС при постановке соответствующих диагнозов согласно рекомендациям (International PNH Interest Group (I-PIG)).

Способ прошел клинические испытания на кафедре клинической лабораторной диагностики РМАПО. Были обследованы 572 пациента, направленные из различных ЛПУ с предварительным диагнозом или подозрением на пароксизмальную ночную гемоглобинурию (ПНГ), апластическую анемию (АА), миелодиспластический синдром (МПС), аутоиммунной гемолитической анемией (АИГА), в возрасте от 12 до 82 лет.

Всем пациентам проведена диагностика по предлагаемому способу с использованием метода многоцветной проточной цитометрии, а также согласно международному стандартизованному подходу.

Определено отсутствие защитного белка CD59 на мембране ретикулоцитов, выделенных по CD235a (панэритроцитарный маркер) и CD71 (рецептор к трансферрину) и дополнительно очищенных методом последовательного гейтирования по параметрам светорассеяния FS/SS, доказана высокая корреляция объема ПНГ-клона, измеренного среди ретикулоцитов, согласно предложенному способу с ПНГ-клоном среди гранулоцитов и моноцитов, измеренными согласно международному стандартизованному подходу.

Обследовано 572 человека в возрасте от 15 до 64 лет, из них 248 мужчин и 324 женщины. Из 572 обследованных ПНГ-клон обнаружен у 175 пациентов, значения варьировали от 0,1% до 99,7% (медиана 41,6%). Среди них 78 мужчин и 97 женщин. Всем пациентам проведены параллельные исследования ПНГ-клона согласно международному стандартизованному подходу и с помощью предлагаемого способа. Корреляция между значением ПНГ-клона среди ретикулоцитов и гранулоцитов составила 0,93, среди ретикулоцитов и моноцитов 0,95 соответственно. Чувствительность метода составила 98,9%, специфичность 99,8%, общая точность 99,7%.

В основном при апластической анемии и миелодиспластическом синдроме ПНГ-клон составляет менее 1%. Согласно рекомендациям, клоны такого размера необходимо исследовать в динамике с периодичностью 1 раз в 6 мес. При увеличении размера клона и соответствующих клинических признаках идет речь о постановке диагноза ПНГ.

Пример. Пациент М., 34 лет, находился под наблюдением гематолога. После перенесенного ОРВИ наблюдались усиление слабости, желтуха, потемнение мочи.

Пациент поступил в отделение лечебно-профилактического учреждения (ЛПУ) с жалобами на слабость и потемнение мочи.

Проведено плановое обследование в поликлиническом отделении ЛПУ. При объективном обследовании выявлены иктеричность кожных покровов и видимых слизистых оболочек. Пациент госпитализирован в гематологическое отделение с жалобами на общую слабость, недомогание, одышку, тахикардию, темный цвет мочи, снижение количества гемоглобина и эритроцитов.

Пробирка с образцом стабилизированной К 2 ЭДТА периферической крови направлена на кафедру клинической лабораторной диагностики РМАПО в референс-центр по изучению ПНГ для выявления ПНГ-клона методом проточной цитометрии. Анализ ПНГ-клона среди гранулоцитов, моноцитов и эритроцитов был сделан согласно международному протоколу, также исследование ПНГ-клона проводилось с помощью предлагаемой методики на эритроцитах и ретикулоцитах.

Одновременно производилось исследование ПНГ клона согласно международному протоколу и по предлагаемой методике (повторение предыдущего предложения!). Согласно международному протоколу образец был окрашен для выявления ПНГ-клона среди гранулоцитов, моноцитов и эритроцитов, а согласно предлагаемой авторами методике для выявления ПНГ-клона среди эритроцитов и ретикулоцитов. По предлагаемой методике образец был окрашен с помощью моноклональных антител к CD235a(FITC)/CD59(PE)/CD71(APC) путем их поочередного внесения в 40 мкл разведенной 1:10 цельной крови.

После инкубации 15 минут в темноте клетки отмывали дважды в 4 мл фосфатно-солевого буфера в режиме центрифугирования в течение 5 мин с частотой 1500 об/мин.

После каждого центрифугирования отбирался супернатант, при этом клетки оставались на дне пробирки.

Готовый образец ресуспендировался 5 секунд на вортексе и добавлялось 750 мкл PBS.

Для исследования эритроцитов и ретикулоцитов на графике FSC(log) vs SSC(log) выделялась область эритроцитов за исключением дебриса и дуплетов.

Затем на графике FSC(log) vs CD235a выделялись CD235a - позитивные клетки, исключая дебрис и клетки, не относящиеся к популяции CD235a+, неспецифически связавшие моноклональные антитела к CD235a. События, вошедшие в гейт CD235a+, анализировались на графике CD71 vs FSC(log), на нем выделили популяцию, позитивную по CD71.

Для объективной оценки ПНГ-клона среди ретикулоцитов в гейте CD71+ собрали не менее 20000 событий.

В зависимости от гейта CD71+ строили график FSC(log) vs SSC(log). Затем на этом графике с помощью дополнительного гейта CD71str выделяли популяцию ретикулоцитов, которая таким образом была очищена от дебриса и дуплетов методом последовательного гейтирования.

Далее на графике CD235a vs CD59 в зависимости от гейта CD71str (выделенные ретикулоциты) оценивали ретикулоциты на предмет наличия GPI-связанного белка CD59 на мембранах ретикулоцитов, соответственно, ПНГ-позитивные и ПНГ-негативные клетки. Статистические данные отражались в абсолютных значениях и % от гейта.

При выделении ретикулоцитов по CD71 и последующей очистке от дебриса, клетки CD59- популяции составили 97,6%. Таким образом, с помощью предлагаемого способа обнаружен ПНГ-клон.

Исследование согласно мждународному протоколу выявления ПНГ подтвердило, что ПНГ-клон присутствует на гранулоцитах, моноцитах и эритроцитах в размере 99,2%, 97,6% и 71,0% соответственно, что говорит о воспроизводимости результатов предлагаемой и стандартной методики. Проведение данного теста послужило основанием для постановки диагноза пароксизмальной ночной гемоглобинурии.

Клинические испытания показали, что предлагаемый способ обладает высокой достоверностью, точностью и чувствительностью (0,1% ПНГ-клона), позволяет определить наличие как высоких значений клона у пациентов с пароксизмальной ночной гемоглобинурией, так и минорных значений (от 0,1%) у пациентов с апластической анемией, миелодиспластическом синдромом. Предложенная методика является простой в выполнении, не требует больших материальных затрат, проведение одного теста занимает 40-50 минут.

Методика хорошо подходит для скрининга пациентов и является доступной для медицинских учреждений разного профиля, а также для всех категорий граждан.

Способ лабораторной диагностики пароксизмальной ночной гемоглобинурии, включающий окрашивание цельной крови пациента моноклональными антителами в фосфатно-солевом буфере, инкубирование, отмывку клеток крови от несвязавшихся моноклональных антител путем центрифугирования, ресуспендирование готового образца, последующее проведение оценки размера клона или его отсутствия в программе проточного цитометра по отсутствию или наличию защитных белков, отличающийся тем, что для окрашивания исследуемого образца крови используют трехцветную комбинацию моноклональных антител CD235a (FITC)/ CD59(PE)/CD71 (АРС), которые добавляют в пробирку с образцом, наличие ПНГ-клона среди эритроцитов и ретикулоцитов оценивают по отсутствию защитного белка CD59 на мембране ретикулоцитов, выделенных по гейту CD235a - панэритроцитарному маркеру и CD71- рецептору к трансферрину, для оценки ПНГ-клона среди ретикулоцитов в гейте CD71+ собирают не менее 20000 событий, в зависимости от гейта CD71+ строят график FSC(log) vs SSC(log), на котором с помощью дополнительного гейта CD71str выделяют ретикулоциты, очищая таким образом популяцию ретикулоцитов от дебриса и дуплетов методом последовательного гейтирования, полученные значения показателей сравнивают с критериями нормы, и при наличии 100% положительных по CD59 ретикулоцитов судят об отсутствии ПНГ-клона и диагностируют отсутствие заболевания пароксизмальной ночной гемоглобинурии, при выявлении у пациента с клиническими симптомами негативных CD59- ретикулоцитов и значении полученных показателей более 1% дают диагностическое заключение о наличии ПНГ-клона и для подтверждения диагностики пароксизмальной ночной гемоглобинурии рекомендуют дополнительное исследование по международному стандартизованному протоколу, при выявлении негативных по CD59-ретикулоцитов и значении полученных показателей 0,1-1% судят о наличии минорного ПНГ-клона и рекомендуют повторное определение ПНГ-клона через 6 мес на предмет увеличения его значения и развития пароксизмальной ночной гемоглобинурии, при подтверждении такого размера клона диагностируют субклиническую форму пароксизмальной ночной гемоглобинурии без клинических признаков.

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и может быть использовано для диагностики наследственной оптической нейропатии (НОН). Для этого проводят клинические и цитологические исследования и дополнительно из кожи пациента получают культуру фибробластов плотностью 5000-10000 клеток на см2, окрашивают митохондриальным потенциалзависимым флюоресцентным красителем TMRE до конечной концентрации 25 нМ.

Изобретение относится к медицине и описывает хемилюминесцентный реактив для определения присутствия и/или количества анализируемого вещества в образце с предполагаемым содержанием анализируемого вещества, при этом реактив является недисперсным и растворимым в водной среде и содержит партнера по связыванию для анализируемого вещества и хемилюминесцентную композицию, содержащую олефиновое соединение и хелат металла, где олефиновое соединение является соединением, которое способно реагировать с синглетным кислородом присоединением 2+2 с образованием диоксетана или которое способно реагировать с синглетным кислородом с циклоприсоединением 4+2 с диенами, и где металл или хелат металла представляет собой редкоземельный металл или металл Группы VIII, и где металл координирован с двумя или более атомами той же молекулы или хелирующего агента, где два или более атомов выбраны из группы, состоящей из кислорода, азота и серы.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использована для определения еx-vivo эффективности лечения рака. Для этого после введения одной или более доз иммуногенной композиции субъекту измеряют уровень активированных Т-лимфоцитов (CD3+ CD69+) в организме.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для определения генотипа человека по полиморфизму в гене матриксной металлопротеиназы ММР9-1562 C>Т (rs3918242).

Изобретение касается способа определения биологической активности эмбрионированных яиц Trichuris. Охарактеризованный способ включает осуществление по меньшей мере 3-х анализов, выбранных из: - оценки и/или подтверждения стадии эмбрионального развития яиц с помощью метода количественной ПЦР с использованием пригодных маркерных последовательностей для определения количества копий геномной ДНК, - оценки метаболической активности эмбрионированных яиц с помощью биохимических и/или молекулярно-биологических методов, - оценки индуцибельности генной экспрессии в эмбрионированных яйцах, - оценки подвижности личинок Trichurs с помощью микроскопа в течение продолжительных периодов наблюдения после предварительной инкубации при повышенных температурах и/или - оценки коэффициента вылупляемости личинок Trichuris в организме лабораторного животного.

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, и может быть использовано для прогнозирования риска сердечно-сосудистой летальности у пациентов с постинфарктной хронической сердечной недостаточностью, сочетающейся с сахарным диабетом 2 типа.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии и клинической биохимии. Сущность способа заключается в том, что фиксированные клетки периферической крови обрабатывают первичными антителами к эстроген-связываюшему белку, специфически взаимодействующими с антигенами на поверхности сегментоядерных гранулоцитов, затем к полученному комплексу антиген-антитело добавляют вторичные антивидовые флуоресцентно-меченные антитела, и при наличии окрашивания поверхности сегментоядерных гранулоцитов диагностируют злокачественные новообразования, а при отсутствии окрашивания поверхности сегментоядерных гранулоцитов диагностируют доброкачественные новообразования.

Изобретение относится к области медицины, а именно к онкологии, и может быть использовано для прогнозирования развития гематогенных метастазов после комбинированного лечения при раке почки.

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования задержки внутриутробного роста плода. Для этого в венозной крови женщины на ранних сроках беременности определяют относительное содержание CD3+CD16+56+-лимфоцитов, уровня С3-компонента комплемента и растворимого рецептора фактора некроза опухоли (sTNF-R).

Изобретение относится к медицине, а именно к гастроэнтерологии, и может быть использовано для диагностики нагноившейся постнекротической псевдокисты поджелудочной железы. Для этого в крови больного определяют активность фагоцитов по уровню экспрессии CD 14+/HLA-DR+ методом проточной цитометрии и статистического ROC-анализа. При содержании CD14+/HLA-DR+ ниже 85% диагностируют нагноившуюся постнекротическую псевдокисту поджелудочной железы. Использование данного способа позволяет диагностировать нагноившуюся постнекротическую псевдокисту поджелудочной железы, что позволяет определять тактику ведения таких больных и осуществлять выбор оперативного вмешательства. 2 пр., 1 табл.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкогематологии, и может быть использовано для прогнозирования развития безрецидивной выживаемости у больных множественной миеломой после аутологической трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. Целью изобретения является упрощение способа прогнозирования безрецидивной выживаемости у больных множественной миеломой после АТГСК. Способ прогнозирования безрецидивной выживаемости у больных множественной миеломой после аутологичной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (АТГСК), включает проточную цитометрию и оценку относительного содержания одной из популяций лимфоцитов с использованием ее порогового значения. В предложенном способе после процедуры афереза, перед трансплантацией в продукте афереза больного определяют относительное количество CD45+CD19+ В-клеток, и при содержании CD45+CD19+ В-клеток более 2,5% прогнозируют более короткий период безрецидивной выживаемости после АТГСК, а при содержании CD45+CD19+ В-клеток менее 2,5% прогнозируют более продолжительный период безрецидивной выживаемости после АТГСК. 1 ил.

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и может быть использовано для оценки реакции бласттрансформации лимфоцитов. Для этого используют бруцеллин для специфической активации лимфоцитов. Детекцию бластных форм лимфоцитов проводят с помощью моноклональных антител к CD34 с последующим подсчетом клеток методом проточной цитофлуориметрии. Использование данного способа позволяет проводить учет активированных бруцеллином лимфоцитов в РБТЛ с использованием моноклональных антител CD34 у больных бруцеллезом и здоровых доноров. 1 табл.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для определения антител к аллогенным HLA-G в сыворотки крови. Для этого используют тест перекрестной совместимости (cross match) мононуклеаров донора с сывороткой реципиента. Проводят анализ субпопуляций мононуклеаров с помощью проточной цитофлуорометрии на связывание моноклональных антител HLA-G и оценивают степень экспрессии HLA-G на опытных и контрольных мононуклеарах донора. При этом значимыми являются субпопуляции CD3-HLA-G+ и CD3+HLA-G+, по которым рассчитывают коэффициент подавления (КП) в опытной постановке по отношению к контрольной по формуле: КП HLA-G = (H L A − G О П − H L A − G К О Н Т) H L A − G К О Н Т × 100, где HLA-Gоп - суммарное относительное число субпопуляций экспрессирующих HLA-G: (CD3-HLA-G++CD3+HLA-G+) в опытной постановке, %; HLA-Gконт - суммарное относительное число субпопуляций экспрессирующих HLA-G: (CD3-HLA-G++CD3+HLA-G+) в контрольной постановке, %. При этом наличие сенсибилизации к аллогенным HLA-G диагностируют при отрицательном значении КПHLA-G. Использование данного способа позволяет выявлять аллогенную сенсибилизацию к HLA-G с помощью проточной цитофлуориметрии, определяя субпопуляции CD3-HLA-G+ и CD3+HLA-G+. 3 пр., 3 ил., 2 табл.

Изобретение относится к области медицины, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования рецидива угрожающего выкидыша. Для этого проводят иммунологическое исследование периферической венозной крови в 7-12 недель гестации у женщин с угрозой невынашивания беременности. После проведенного лечения угрозы прерывания беременности определяют относительное содержание CD45RA-CD62L- в популяции CD8+ лимфоцитов. При его значении более 23,9% прогнозируют возникновение угрожающего выкидыша во втором триместре у женщин с привычным невынашиванием в анамнезе. Использование данного способа позволяет прогнозировать рецидив угрожающего выкидыша во втором триместре гестации, что позволит выбрать правильную тактику ведения беременной женщины, позволит снизить частоту данного осложнения. 1 табл., 4 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к трансфузиологии, и может быть использовано для контроля эффективности облучения донорской крови. Способ включает постановку реакции бласттрансформации клеток крови с митогеном фитогемагглютинином и учет результатов реакции путем определения индекса стимуляции лимфоцитов. Постановку реакции проводят в отношении облученной донорской крови, учет результатов выполняют с помощью проточного цитофлюориметра с использованием моноклональных антител, меченных разными флюорохромами, проведением гейтирования активированных лимфоцитов со сниженной экспрессией общелейкоцитарного маркера CD45 и определением среди них процента дубль-негативных Т-лимфоцитов с иммунофенотипом CD3+CD4-CD8-, при этом в качестве контроля берут необлученный образец той же крови. После чего определяют эффективность облучения по соотношению содержания дубль-негативных Т-лимфоцитов с иммунофенотипом CD3+CD4-CD8- в проверяемой облученной и той же необлученной контрольной крови как Эоб=Сднтло-Сднтлк, где Эоб - эффективность облучения, Сднтло - процент содержания дубль-негативных Т-лимфоцитов с иммунофенотипом CD3+CD4-CD8- в опыте (в проверяемой облученной крови), Сднтлк - процент содержания дубль-негативных Т-лимфоцитов с иммунофенотипом CD3+CD4-CD8- в контроле (в необлученном образце той же крови). При разнице с контролем более чем в 50% делают вывод о функциональной неполноценности Т-лимфоцитов в облученной крови и иммунологической безопасности данного препарата крови для реципиента. Использование данного способа позволяет определять эффективность облучения донорской крови методом проточной цитометрии.

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, и позволяет прогнозировать угрожающий поздний выкидыш у беременных женщин. Для этого в сроке 5-12 недель гестации определяют относительное количество CD178+ моноцитов гестации в периферической венозной крови. При его значении равном 37,7% или менее в моноцитарном гейте прогнозируют угрожающий поздний выкидыш у женщин с угрозой прерывания беременности ранних сроков и привычным невынашиванием в анамнезе. Использование данного способа позволяет выбрать правильную тактику ведения беременности, провести комплекс лечебно-профилактических мероприятий и снизить риск развития осложнений и неблагоприятных исходов беременности в группе женщин с высоким риском невынашивания беременности. 3 пр., 1 табл.

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству, и касается выбора тактики ведения беременных с плацентарной недостаточностью и синдромом задержки роста плода (СЗРП). Для этого у пациенток с фетоплацентарной недостаточностью и ЗРП в сыворотке крови иммуноферментным методом определяют активность супероксиддисмутазы, содержание фактора роста плаценты, эндоглина и мелатонина. По этим показателям рассчитывают прогностический коэффициент П по формуле: П=(0,0001*COD+0,0255*Mel+0,1636*CD105+(-0,0487*PGF)-8,5389, где COD - супероксиддисмутаза, пг/мл, Mel - мелатонин, пг/мл, CD 105 - эндоглин, пг/мл, PGF - фактор роста плаценты, пг/мл. При величине П равной 0,64 и более прогнозируют высокий риск развития критического состояния плода в антенатальном периоде, что требует завершения беременности путем операции кесарево сечение в экстренном порядке в интересах плода. Способ обеспечивает повышение точности прогнозирования критического состояния плода антенатально, что позволяет своевременно выбрать адекватную тактику ведения пациентки. 2 пр.

Изобретение относится к области медицины, а именно к отоларингологии, и может быть использовано для дифференциальной экспресс-диагностики острых вирусных и бактериальных тонзиллитов у взрослых. Для этого проводят забор периферической крови и определяют относительное содержание субпопуляций нейтрофильных гранулоцитов, одновременно экспрессирующих CD16, CD11b на поверхностной мембране. Принимают за норму наличие субпопуляции CD16brightCD11bdimНГ% от 80 и до 99,9% с высокой плотностью экспрессии CD16 и низкой плотностью экспрессии CD11b. При условии выявления субпопуляции CD16brightCD11bbrightНГ или CD16dimCD11bbrightНГ в количестве от 40% и более определяют соответственно острую вирусную инфекцию или острую бактериальную инфекцию. Использование данного способа позволяет обеспечить точность дифференциальной диагностики острых вирусных и бактериальных тонзиллитов у взрослых. 3 пр., 1 табл.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использована для одновременного выявления представителей условных таксономических групп микроорганизмов, патогенных для человека и животных. Характеризуется использованием как минимум пяти иммунохроматографических стрип-тестов, размещенных в едином корпусе. При этом в первом и втором каналах корпуса устройства находятся стрип-тесты для выявления токсинов, в третьем канале - стрип-тест для выявления вегетативных форм бактерий, в четвертом - споровых форм бактерий, а в пятом - стрип-тест для выявления питательной среды культивирования вирусов и риккетсий. Тестирование ведут путем укладки корпуса иммунохроматических стрип-тестов в теплоизолирующий цефленовый пакет, состоящий из двух слоев цефлена, с теплоизолирующей прокладкой из пористого теплоизолирующего материала между ними, а корпус иммунохроматографических стрип-тестов внутри пакета нагревают источником постоянного тепла, причем отверстие пакета закрывают механическим зажимом и считают этот момент началом тестирования. Также предложено устройство для иммунохроматографического анализа. Группа изобретений позволяет увеличить производительность иммунохроматографического анализа, расширить температурный диапазон иммунохроматографического анализа от минус 20 до плюс 50°C, сократить время получения результата до 10 мин по сравнению с анализом при комнатной температуре (20 мин), при условии достижения одинаковой чувствительности, повысить чувствительность анализа по сравнению с анализом, проводимым при комнатной температуре. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 5 ил., 4 табл., 8 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для диагностики пароксизмальной ночной гемоглобинурии. Для этого окрашивают исследуемый образец крови моноклональными антителами CD235a CD59CD71. Наличие ПНГ-клона среди эритроцитов и ретикулоцитов оценивают по отсутствию защитного белка CD59 на мембране ретикулоцитов, выделенных по гейту CD235a - панэритроцитарному маркеру и CD71- рецептору к трансферрину. Для оценки ПНГ-клона среди ретикулоцитов в гейте CD71+ собирают не менее 20000 событий, в зависимости от гейта CD71+ строят график FSC vs SSC, на котором с помощью дополнительного гейта CD71str выделяют ретикулоциты, очищая таким образом популяцию ретикулоцитов от дебриса и дуплетов методом последовательного гейтирования. При наличии 100 положительных по CD59 ретикулоцитов судят об отсутствии ПНГ-клона и диагностируют отсутствие заболевания пароксизмальной ночной гемоглобинурии. При выявлении у пациента с клиническими симптомами негативных CD59- ретикулоцитов и значении полученных показателей более 1 дают диагностическое заключение о наличии ПНГ-клона и для подтверждения диагностики пароксизмальной ночной гемоглобинурии рекомендуют дополнительное исследование по международному стандартизованному протоколу. При выявлении негативных по CD59-ретикулоцитов и значении полученных показателей 0,1-1 судят о наличии минорного ПНГ-клона и рекомендуют повторное определение ПНГ-клона через 6 мес на предмет увеличения его значения и развития пароксизмальной ночной гемоглобинурии, и при подтверждении такого размера клона диагностируют субклиническую форму пароксизмальной ночной гемоглобинурии без клинических признаков. Использование многопараметрического гейтирования CD71+ клеток позволяет добиться исключения из анализа дебриса, дублетов и от неспецифически связавшихся моноклональных антител. 1 ил.

Материалы представлены из учебного пособия РУДН

Анемии. Клиника, диагностика и лечение / Стуклов Н.И., Альпидовский В.К., Огурцов П.П. – М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2013. – 264 с.

Копирование и тиражирование материалов без указания авторов запрещено и преследуется по закону.

Пароксизмальная ночная гемоглобинурия (ПНГ) – это приобретенная клоновая гемолитическая анемия, связанная с дефектом мембраны клеток крови, поэтому заболевание рассматривается в группе мембранопатий и является единственной приобретенной мембранопатией среди болезней этой группы. Мутация, приводящая к дефекту мембраны при ПНГ происходит на уровне полипотентной стволовой клетки, причем причина мутации остается неясной.

ПНГ встречается с частотой 1:500000 населения. Болеют люди всех возрастных групп, но чаще – в возрасте 30 – 40 лет. Мужчины и женщины болеют одинаково часто.

Этиология и патогенез

Точечная мутация гена PIGA на 22 хромосоме или Х-хромосоме полипотентной стволовой клетки (ПСК) приводит к нарушению образования на поверхности клеток крови фосфатидилинолиновой кислоты и белков CD 55 и CD 59, формирующих в нормальных клетках систему, блокирующую повреждающее действие на мембрану активизированного комплемента за счет образования каскада CD 5 b –9 – комплекса, протеолитически воздействующего на клеточную мембрану.

Таким образом, отсутствие на поверхности клеток крови факторов, препятствующих функции комплемента, и приводит к лизису дефектных эритроцитов, нейтрофилов и тромбоцитов.

При ПНГ в крови больных существуют два клона: нормальный и патологический, и от соотношения этих клонов во многом зависит клиническая картина и тяжесть течения болезни.

Клиника

Протеолитическое действие активированного комплемента приводит к внутрисосудистому разрушению дефектных эритроцитов, что проявляется гемоглобинурией . Активация комплемента происходит ночью во время сна, вследствие сдвига рН в кислую сторону.

Клинически гемолиз во время сна проявляется выделением черной мочи во время утреннего диуреза, жалобами на недомогание, головокружение, появление желтизны склер. Кроме того, гемолиз могут провоцировать инфекционные заболевания и некоторые лекарственные средства.

Помимо анемических симптомов, связанных с гемолизом, важную роль в клинике ПНГ играют тромботические осложнения , обусловленные освобождением из разрушенных клеток тромбопластина и ряда активных ферментов.

Нередко, одной из первых жалоб больного являются боли в животе, симулирующие разнообразную острую абдоминальную патологию. Боли в животе связаны с тромбозами мелких мезентериальных артерий.

Тромбофлебит встречается у 12% больных ПНГ и может протекать по-разному. При одном из вариантов состояние больных вне кризов вполне удовлетворительное, содержание Hb – около 80 – 90 г/л. У других больных тяжелые гемолитические кризы следуют один за другим, приводя к выраженной анемии. Они часто сопровождаются тромботическими осложнениями.

Лабораторные данные

Во время гемолитического криза может наблюдаться резкое снижение уровня гемоглобина до 20 г/л и ниже, и параллельное снижение числа эритроцитов. В период ремиссии содержание Hb и эритроцитов повышается, однако, в редких случаях достигает нижней границы нормы.В отличие от большинства мембранопатий, дефект оболочки эритроцитов при ПНГ не сопровождается характерными изменениями формы патологических эритроцитов. Анемия в большинстве случаев носит нормоцитарный и нормохромный характер. Однако, при значительной потере железа с мочой (в результате гемоглобинурии и гемосидеринурии) развивается гипохромия эритроцитов. Содержание ретикулоцитов повышено, но в значительно меньшей степени, чем при врожденных мембранопатиях со сходной интенсивностью гемолиза. Аномальных гемоглобинов и снижения активности энзимов (кроме ацетилхолинэстеразы) в эритроцитах при ПНГ не обнаружено. Осмотическая резистентность эритроцитов не изменена. При инкубации эритроцитов больных ПНГ в стерильных условиях наблюдается больший, чем в норме аутогемолиз, который, однако, не уменьшается при добавлении глюкозы.

Число лейкоцитов в большинстве случаев снижено вследствие нейтропении. Иногда наблюдается левый сдвиг в лейкограмме.

Число тромбоцитов обычно также снижено. Функции тромбоцитов не нарушены.

При исследовании костного мозга обнаруживается эритроидная гиперплазия и признаки недостаточности костномозгового кроветворения в виде нарушения вызревания клеток красного ряда и гранулоцитарных элементов, а также уменьшение числа мегакариоцитов, нередко с нарушением отшнуровки кровяных пластинок. У некоторых больных ПНГ наряду с признаками дисгематопоэза обнаруживается костномозговая гипоплазия, свойственная апластической анемии.

В тех случаях, когда комплемент-чувствительные ПНГ-эритроциты и симптомы внутрисосудистого гемолиза обнаруживаются у больных с ранее установленной аплазией кроветворения, диагностируется ПНГ-синдром, развившийся на фоне апластической анемии.

Однако, следует помнить о редких случаях ПНГ, которые заканчиваются апластической анемией вследствие истощения костномозгового кроветворения тяжелыми гемолитическими кризами и другими неблагоприятными воздействиями (инфекции, некоторые лекарственные агенты и т.д.).

Важным лабораторным признаком ПНГ является гемоглобинурия. Содержание свободного гемоглобина в плазме вследствие внутрисосудистой деструкции эритроцитов при ПНГ, в зависимости от выраженности гемолиза, колеблется от 11 до 280 мг% (при норме до 4 мг%).

Содержание билирубина обычно нерезко повышено, в основном за счет неконъюгированной фракции. Уровень железа сыворотки при ПНГ зависит от фазы заболевания: при гемолитических кризах в связи с выходом железа гемоглобина в плазму наблюдается ферритинемия, а в период спокойного течения из-за потери железа с мочой – гипоферритинемия. Дефицит железа при ПНГ, в отличие от железодефицитных анемий, сопровождается одновременным понижением общей и латентной железосвязывающей способности, обусловленным, по-видимому, нарушением синтеза трансферрина в печени.

При исследовании мочи у большинства больных ПНГ обнаруживается гемоглобинурия. При ПНГ гемоглобин появляется в моче при его сравнительно невысокой концентрации в плазме, что связано с понижением содержания плазменного гаптоглобина. Во время экскреции гемоглобина почками часть его реабсорбируется и откладывается в эпителии канальцев виде гемосидерина, который затем выделяется с мочой. Интересно, что гемосидеринурию при ПНГ удается уловить чаще, чем гемоглобинурию, поскольку она развивается и вне гемолитического криза.

Диагностика заболевания связана с выявлением характерной клинической картины, лабораторными признаками внутрисосудистого гемолиза (гемоглобинемия (красный цвет сыворотки крови после центрифугирования), снижение гаптоглобина к крови, незначительная непрямая биллирубинемия, увеличение ЛДГ, гемоглобинурия, гемосидеринурия). Диагноз ПНГ основывается на обнаружении свойственных этому заболеванию комплемент-чувствительных эритроцитов. Для этой цели используются кислотный тест Хема и более чувствительная сахарозная проба .

При постановке теста Хема исследуемые эритроциты инкубируются в подкисленной до рН 6,4 нормальной сыворотке. В этих условиях лизируются только комплемент-чувствительные эритроциты. Следует помнить, что при небольшом содержании ПНГ-эритроцитов в крови больного и при низкой активности комплемента в сыворотке тест Хема может дать отрицательные результаты.

Более чувствительной является сахарозная проба, при которой исследуемые эритроциты и небольшое количество нормальной сыворотки помещаются в изотонический раствор сахарозы. В условиях пониженного напряжения в сахарозной среде происходит более активная фиксация комплемента на поверхности эритроцитов и лизис комплемент-чувствительных ПНГ-эритроцитов.

Доказательством наличия ПНГ-клона является обнаружение на мембране клеток, признаков, характерных для повреждения гена PIG A. Современные методы проточной цитофлуорометрии позволяют определять наличие эритроцитов с полным или частичным дефицитом молекул CD59 на мембране, однако патологические эритроциты не всегда могут обнаруживаться, учитывая наличие выраженного их гемолиза. Наиболее достоверным является исследование гранулоцитов моноцитов, так как ядросодержащие клетки менее подвержены действию комплемента.

Лечение

Вследствие отсутствия четких представлений о патогенезе ПНГ лечение этого заболевания в настоящее время носит симптоматический характер.

В целях борьбы с анемией используются заместительные гемотрансфузии, частота которых зависит от выраженности гемолиза и компенсаторной активности костного мозга. Следует помнить, что переливание свежей цельной крови больным ПНГ часто сопровождается усилением гемолиза. Причина этой реакции неясна. Больные ПНГ лучше переносят переливания цельной крови или эритроцитарной массы длительных сроков хранения (более 7 – 8 дней) и трансфузии 3 – 5-кратно отмытых эритроцитов, освобожденных от лейкоцитов и тромбоцитов. Применение отмытых эритроцитов является лучшим трансфузиологическим методом в лечении ПНГ. При появлении реакции и на отмытые эритроциты из-за развития изосенсибилизации необходим индивидуальный подбор донора по непрямой реакции Кумбса (рис. 12).

Важное место в лечении ПНГ занимают препараты железа и андрогенные гормоны . Терапия препаратами железа рекомендуется больным с ПНГ при обнаружении гипохромии эритроцитов и снижения уровня железа сыворотки в период спокойного течения заболевания. Препараты железа нужно применять осторожно (небольшими дозами и только peros ), поскольку известна их способность провоцировать у некоторых больных ПНГ тяжелые гемолитические кризы.

Использование андрогенов при ПНГ основывается на стимулирующем влиянии этих гормонов на эритропоэз. Назначение Нерабола или его аналогов в дозе 30 – 40 мг/день способствует более быстрому восстановлению уровня гемоглобина после гемолитического эпизода и тем самым заметно снижает потребность в гемотрансфузиях. Особенно эффективным оказывается применение андрогенов при ПНГ с гипоплазией кроветворения.

Тактика лечения тромботических осложнений зависит от локализации тромбозов, их давности и состояния свертывающей системы. В случаях, когда это осложнение угрожает жизни больного, необходимо применение комплексной тромболитической и антикоагулянтной терапии (фибринолизин или урокиназа, никотиновая кислота, гепарин и антикоагулянты непрямого действия) по общетерапевтическим правилам и в достаточных дозировках.

Поскольку имеются сообщения об усилении гемолиза после введения гепарина, этот антикоагулянт должен применяться с большой осторожностью.

Спленэктомия при ПНГ не показана, так как послеоперационный период часто осложняется тромбозами мезентериальных сосудов. Риск операции допустим только при наличии выраженных симптомов гиперспленизма: глубокой лейкопении, осложненной частыми инфекциями и/или тромбоцитопении, сопровождающиеся тяжелым геморрагическом синдромом.

Разработан современный геннотехнологический препарат Экулизумаб(eculizumab) (Солирис, SOLIRIS®), который зарегистрирован FDA (Food and Drug administration)для лечения детей и взрослых, страдающих ПНГ. Экулизумаб является гликозилированным гуманизированным моноклональным антителом - каппа-иммуноглобулином (IgG2/4k), который связывается с белком С5 комплемента человека и подавляет активацию комплемент-опосредованного лизиса клеток. Антитело состоит из константных участков иммуноглобулина человека и комплементарно-детерминированных участков иммуноглобулина мыши, встроенных в вариабельные области легкой и тяжелой цепей человеческого антитела. В состав экулизумаба входят две тяжелые цепи, по 448 аминокислот в каждой, и две легкие цепи, по 214 аминокислот в каждой. Молекулярная масса составляет 147870 Да. Экулизумаб продуцируется в культуре клеток линии NS0 миеломы мыши и очищается с помощью аффинной и ионообменной хроматографии. В процессе производства субстанции включены также процессы специфической инактивации и удаления вирусов.

Экулизумаб подавляет терминальную активность комплемента человека, обладая высокой аффинностью к его С5-компоненту. Как следствие, полностью блокируется расщепление компонента С5 на С5а и С5b и образование терминального комплекса комплемента С5b–9. Таким образом, экулизумаб восстанавливает регуляцию активности комплемента в крови и предотвращает внутрисосудистый гемолиз у больных ПНГ. С другой стороны, дефицит терминального комплемента сопровождается повышенной частотой развития инфекций инкапсулированными микроорганизмами, главным образом, менингококковой инфекции. При этом экулизумаб поддерживает содержание ранних продуктов активации комплемента, необходимых для опсонизации микроорганизмов и выведения иммунных комплексов. Назначение больным препарата Солирис сопровождается быстрым и стабильным снижением терминальной активности комплемента. У большинства больных ПНГ концентрация экулизумаба в плазме крови порядка 35 мкг/мл достаточна для полного ингибирования внутрисосудистого гемолиза, индуцированного терминальной активацией комплемента.

Благодаря уникальным новым клиническим результатам и открывающимся терапевтическим возможностям для врачей по сохранению полноценной жизни и здоровья больных, Экулизумаб был зарегистрирован в ускоренном порядке, без проведения третей фазы клинических исследований – это позволит сохранить много жизней, как детей так и взрослых.

В связи с этим, вслед за регистрацией в США, Европейский Комитет по лекарственным средствам вынес положительное заключение об ускоренной регистрации Экулизумаба в Европе, которая также ожидается в ближайшее время.

Учитывая высокую стоимость экулизумаба, невозможность с его помощью воздействовать на причину заболевания и то, что применять его необходимо всю жизнь, к нему более всего применима стратегия резерва, предназначенного специально для больных с высоким количеством ПНГ-клеток или для больных с наклонностью к тромбообразованию, не зависящему от величины ПНГ-клона.

В настоящее время единственным способом радикального лечения ПНГ является аллогенная трансплантация костного мозга.

Течение и прогноз

Прогноз зависит от тяжести течения основного заболевания, хуже у больных, зависимых от гемотрансфузий, с тяжёлыми тробмозами. У 10% больных наблюдаются спонтанные ремиссии заболевания, у других трансформация в апластическую анемию, МДС, у 5% – в острый лейкоз. В среднем продолжительность жизни составляет 10 – 15 лет.

ПНГ – хроническое и в настоящее время еще полностью неизлечимое заболевание. Тяжесть ПНГ и прогноз во многом зависят от величины комплемент-чувствительной популяции эритроцитов, компенсаторной способности костного мозга и появления осложнений, особенно венозных тромбозов. Представление о тяжелом прогнозе при ПНГ за последнее время в связи с внедрением активной симптоматической терапии в значительной мере изменилось.

Увеличилось количество больных, длительно находящихся в состоянии клинико-гематологической компенсации и ведущих в это время нормальный образ жизни. Снизилась частота тяжелых, угрожающих жизни тромбозов. У некоторых больных со временем отмечается смягчение течения заболевания с уменьшением пропорции комплемент-чувствительных эритроцитов. В редких случаях описывается полное исчезновение патологических эритроцитов, что свидетельствует о принципиальной возможности излечения заболевания.

Пароксизмальная ночная гемоглобинурия (ПНГ) — это приобретенное заболевание, проявляющееся постоянной гемолитической анемией, приступообразной либо постоянной гемоглобинурией, внутрисосудистым гемолизом. Редкость этой разновидности гемолитической анемии характеризует тот факт, что ПНГ страдает 1 человек из полумиллиона, в основном, это люди молодого возраста.

Причины заболевания на настоящий момент времени достоверно неизвестны. Предполагается, что оно возникает из-за возникновения анормального клона эритроцитов, склонных к внутрисосудистому гемолизу. В свою очередь, неполноценность эритроцитов является следствием структурных и биохимических дефектов их мембраны. Известно, что в дефектной мембране активируется перекисное окисление липидов, что способствует скорейшему лизису эритроцитов, кроме этого, в патологический процесс вовлекаются анормальные клоны гранулоцитов и тромбоцитов. Главная же роль в происхождении тромботических осложнений ПНГ принадлежит интрасосудистой деструкции эритроцитов и инициация свертывания крови факторами, высвобождающимися при этом. ПНГ, как правило, начинается постепенно, и протекает хронически с периодическими кризами. Кризы провоцируют вирусные инфекции, оперативные вмешательства, психоэмоциональные стрессы, месячные, применение ряда лекарственных препаратов и пищевых продуктов.

Симптомы пароксизмальной ночной гемоглобинурии

Симптомы ПНГ в период криза:

• приступообразные боли в брюшной полости;
• боли в поясничной области;
• иктеричность кожного покрова и склер; гипертермия; пастозность лица;
• черная окраска мочи, преимущественно, в ночное время;
• резкое снижение артериального давления;
• транзиторное увеличение селезенки;
• прекращение выделения мочи.

В ряде случаев гемолитический криз заканчивается летально.

Симптомы ПНГ вне криза:

• общая слабость;
• бледная, с желтушным оттенком окраска кожного покрова;
• анемия;
• склонность к тромбообразованию; гематурия; повышенное артериальное давление; увеличение печени; одышка; сердцебиение; частые инфекционные заболевания.

Диагностика

• Анализ крови: анемия (нормохромная, в дальнейшем, гипохромная), умеренная лейкоцито- и тромбоцитопения, уровень сывороточного железа значительно снижен.
• Исследование мочи: ее окрашивание в черный цвет, гемоглобинурия, гемосидеринурия, протеинурия. Бензидиновая проба Грегерсена с мочой положительная.
• Специфичный тест Хэма позитивный.
• Специфичная проба Гартмана позитивная.
• Пунктат костного мозга: гиперплазия красного кроветворного ростка, но при тяжелом течении может наблюдаться и гипоплазия костного мозга, увеличение количества жировой ткани в костном мозге.

Лечение пароксизмальной ночной гемоглобинурии

Лечение ПНГ является симптоматическим и состоит, главным образом, из заместительных гемотрансфузий, объем и частота которых зависят от «отклика» на данные мероприятия. В лечении ПНГ используют метандростенолон в дозе 30-50 мг/сут не менее 2-3 месяцев. Борьба с гипоплазией костного мозга осуществляется путем в/в применения антитимоцитарного иммуноглобулина в дозе 150 мг/сут., в течение от 4 до 10 суток. Рекомендован прием препаратов железа per os в небольших дозировках. Иногда хороший эффект дают кортикостероиды в высоких дозировках. Гипоплазия костного мозга с развитием тромботических осложнений являются показаниями для его трансплантации. Описаны единичные случаи выздоровления от ПНГ, в ряде случаев продолжительность благоприятного течения заболевания составляет несколько десятков лет.

Основные лекарственные препараты

Имеются противопоказания. Необходима консультация специалиста.

Данная патология системы кроветворения, известная как анемия Маркиафавы-Микели, связана с нарушением строения мембран эритроцитов, что ведет к их преждевременной гибели. В результате нарушения баланса молодых и зрелых клеток может развиваться анемия, которая сказывается на работоспособности всех жизненно важных систем. Преждевременный гемолиз является генетической патологией, но не наследуется, поэтому важно знать, как с этим заболеванием бороться. Как проявляет себя пароксизмальная ночная гемоглобинурия и как лечится?

Гемоглобинурия связана с появлением мутации гена PIG-A, который расположен в Х-хромосоме. Почему это происходит – никто не знает.

Процесс мутации происходит на таком микроуровне, что даже современные технологии не могут определить причину возникновения патологии.

Синтез всех клеток кровеносной системы происходит в костном мозге. При наличии мутагенной эритроцитарной единицы все производимые клетки будут наследовать данный дефект. Причина этому — постоянное деление изначально «неправильной» клетки.

Особенность болезни в том, что мембранная оболочка эритроцитов не содержит специальных белковых молекул, которые защищают клетку от преждевременного гемолиза, вызванного постоянным и беспрерывным процессом комплементации. Это в свою очередь провоцирует разрушение эритроцитов и высвобождение свободного гемоглобина в кровь, что имеет свои негативные последствия.

Мутация гена приводит к тому, что эритроциты погибают до того момента, как выполнили свою основную функцию. Их гемолиз не связан с влиянием внешних факторов, образа жизни человека, привычек и наследственности.

Несмотря на то, что заболевание невозможно полностью вылечить, существует коррекционная терапия, с помощью которой можно вести привычный образ жизни.

Распространенность

Пароксизмальная ночная гемоглобинурия обычно дает о себе знать в возрасте 35-45 лет. Проявления в детском и подростковом возрасте считаются большой редкостью и диагностируются с периодичностью один случай в 10-15 лет.

Болезнь встречается крайне редко и не зависит от пола, расы и региона проживания. Ежегодно фиксируется всего 1-2 случая на миллион человек.

Задайте свой вопрос врачу клинической лабораторной диагностики

Анна Поняева. Закончила нижегородскую медицинскую академию (2007-2014) и Ординатуру по клинико-лабораторной диагностике (2014-2016).

Причины

Достоверно определить, что именно спровоцировало развитие генетического заболевания невозможно, поскольку данный процесс неподконтролен медицине. Однако научно установлено, что при диагностировании апластической анемии риски развития гемоглобинурии увеличиваются в десятки раз.

Также наблюдается зависимость апластической анемии у родителей и плода и проявления ночной гемоглобинурии в дальнейшем у ребенка.

Группы риска и предрасполагающие факторы, увы, невозможно установить, поскольку болезнь проявлялся у разных категорий населения, ведущих отличный друг от друга образ жизни.

Классификация

Пароксизмальная ночная гемоглобинурия имеет несколько форм проявления:

Субклиническая – характеризуется отсутствием острой симптоматики, а также возможностью самостоятельно исчезать. Определяется наличием незначительного количества дефективных эритроцитов, что показывает клинический анализ крови. Внешне может сопровождаться постоянной слабостью, одышкой, головокружением и беспричинными болями в животе, которые проходят самостоятельно.

Классическая – имеет более выраженную клиническую картину, так как мутация затрагивает не только эритроциты, но и другие фракции крови, что отягощает состояние здоровья пациента.

Исследования показывают, что механизм гемопоэза (синтеза новых клеток костными структурами) не нарушен, в то время как количественный и качественный состав крови имеет значимые отклонения.

Взаимосвязанная с нарушениями гемопоэза – характеризуется наличием острого течения и стремительного ухудшения общего самочувствия пациента. Причиной являются недостаточность в системе кроветворения, которая развивается из-за перенесенных и осложненных заболеваний с использованием сильнодействующих медикаментов.

Catad_tema Заболевания крови - статьи

МКБ 10: D61.1, D61.2, D61.3, D61.8, D61.9

Год утверждения (частота пересмотра): 2014 (пересмотр каждые 2 года)

ID: КР121

Профессиональные ассоциации:

• Национальное гематологическое общество

Утверждены

­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­ Российское общество гематологов

Согласованы

Научным советом Министерства Здравоохранения Российской Федерации__ __________201_ г.

Критерии качества

Уровень достоверности доказательств

Диагностические мероприятия

Выполне клинический анализ крови расширенный

Выполнено морфологическое и цитохимическое исследования препарата костного мозга

Выполнено цитогенетическое исследование клеток костного мозга

Выполнено морфологическое (гистологическое) исследование препарата костного мозга

Выполнена рентгенография органов грудной клетки и/или компьютерная томография органов грудной клетки и головного мозга

Событийные (смысловые, содержательные, процессные) критерии качества

Выполнено морфологическое и/или гистологическое и/или стандартного цитогенетического исследования препарата костного мозга

Проведена комбинированная иммуносупрессивная терапия (при отсутствии противопоказаний)

Выполнено определение HLA-типирование сиблингов

Выполнена консультация в трансплантационном центре в течение 3-х месяцев от момента констатации рефрактерного течения

Временные критерии оценки качества

Выполнена иммуносупрессивная терапия в течение 1 месяца после гистологического и/или цитогенетического подтверждения диагноза (при отсутствии медицинских противопоказаний)

Выполнена оценка клинико-гематологических показателей в процессе терапии не реже 2 раза в неделю до достижения полного гематологического ответа

Выполнено морфологическое исследование препарата костного мозга с оценкой костномозгового кроветворения после завершения программы терапии

Выполнено стандартное цитогенетическое исследование препарата костного мозга (исследование не менее 20 метафаз) и/или проведение исследования костного мозга методом флуоресцентной гибридизации (в случае неинформативности цитогенетического исследования для выявления характерных для миелодиспластического синдрома аномалий)

Проведено определение клона пароксизмальной ночной гемоглобинурии методом высокочувствительной проточной цитометрии каждые 6-12 мес, оценка клинико-лабораторных признаков гемолиза

Выполнено морфологическое и/или гистологическое и/или стандартное цитогенетическое исследование перед очередным этапом лечения

Проведен повторный курс антитимоцитарного глобулина, определение HLA-типирование (с целью определения наличия доноров аллогенного костного мозга, при отсутствии ответа через 3-6 месяцев)

Список литературы

1. Кохно А.В., Пименова М.А., Паровичникова Е.Н., Домрачева Е.В. С.В.Г. Выявление скрытых аномалий кариотипа при миелодиспластическом синдроме. / С. В. Г. Кохно А.В., Пименова М.А., Паровичникова Е.Н., Домрачева Е.В. // Гематология и трансфузиология – 2014. – Т. 59 – № 1 – 25–28с.

1. Кулагин А.Д.Апластическая анемия / Кулагин А.Д. / под ред. К.В.А. Лисуков И.А. – – Новосибирск: Наука, 2008. Вып. Наука.
2. Михайлова Е.А. Протокол программного лечения больных апластической анемией: комбинированная иммуносупрессивная терапия / под ред. В.Г.Савченко. Москва: Практика, 2012. – 135–150с.
3. Afable M.G. Clonal evolution in aplastic anemia. / M. G. Afable, R. V Tiu, J. P. Maciejewski // Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program – 2011. – Т. 2011 – 90–5с.
4. Bacigalupo A. Treatment strategies for patients with severe aplastic anemia. / A. Bacigalupo // Bone Marrow Transplant. – 2008. – Т. 42 Suppl 1 – № SUPPL.1 – S42–S44с.
5. Borowitz M.J. Guidelines for the diagnosis and monitoring of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria and related disorders by flow cytometry. / M. J. Borowitz, F. E. Craig, J. A. Digiuseppe, A. J. Illingworth, W. Rosse, D. R. Sutherland, C. T. Wittwer, S. J. Richards // Cytometry B. Clin. Cytom. – 2010. – Т. 78 – № 4 – 211–30с.
6. Kulagin A. Prognostic value of paroxysmal nocturnal haemoglobinuria clone presence in aplastic anaemia patients treated with combined immunosuppression: Results of two-centre prospective study / A. Kulagin, I. Lisukov, M. Ivanova, I. Golubovskaya, I. Kruchkova, S. Bondarenko, V. Vavilov, N. Stancheva, E. Babenko, A. Sipol, N. Pronkina, V. Kozlov, B. Afanasyev // Br. J. Haematol. – 2014. – Т. 164 – № 4 – 546–554с.
7. Marsh J.C.W. Guidelines for the diagnosis and management of aplastic anaemia / J. C. W. Marsh, S. E. Ball, J. Cavenagh, P. Darbyshire, I. Dokal, E. C. Gordon-Smith, J. Keidan, A. Laurie, A. Martin, J. Mercieca, S. B. Killick, R. Stewart, J. A. L. Yin // Br. J. Haematol. – 2009. – Т. 147 – № 1 – 43–70с.
8. Marsh J.C.W. Guidelines for the diagnosis and management of aplastic anaemia. / J. C. W. Marsh, S. E. Ball, J. Cavenagh, P. Darbyshire, I. Dokal, E. C. Gordon-Smith, J. Keidan, A. Laurie, A. Martin, J. Mercieca, S. B. Killick, R. Stewart, J. A. L. Yin // Br. J. Haematol. – 2009. – Т. 147 – № 1 – 43–70с.
9. Marsh J.C.W. Management of the refractory aplastic anemia patient: what are the options ? J. C. W. Marsh, A. G. Kulasekararaj – 2014. – Т. 122 – 3561–3567с.
10. Scheinberg P. Horse antithymocyte globulin as salvage therapy after rabbit antithymocyte globulin for severe aplastic anemia / P. Scheinberg, D. Townsley, B. Dumitriu, P. Scheinberg, B. Weinstein, O. Rios, C. O. Wu, N. S. Young // Am. J. Hematol. – 2014. – Т. 89 – № 5 – 467–469с.
11. Scheinberg P. How I treat acquired aplastic anemia. / P. Scheinberg, N. S. Young // Blood – 2012. – Т. 120 – № 6 – 1185–96с.
12. Young N.S. Epidemiology of Aplastic Anemia // Bone Marrow Fail. Syndr. – 1–46с.
13. Young N.S. The problem of clonality in aplastic anemia: Dr Dameshek’s riddle, restated // Blood. – 1992. – Т. 79. – № 6. – 1385–1392с.
14. Young N.S. Pathophysiologic mechanisms in acquired aplastic anemia. // Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. – 2006. – 72–77с.
15. Young N.S. The relationship of aplastic anemia and PNH. // Int. J. Hematol. – 2002. – Т. 76 Suppl 2. – 168–172с.
16. Zeng Y. The complex pathophysiology of acquired aplastic anaemia. / Y. Zeng, E. Katsanis // Clin. Exp. Immunol. – 2015. – Т. 180 – № 3 – 361–70с.
17. Виноградова М.А.Инфекционные осложнения у больных апластической анемией / Виноградова М.А. – Москва: диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук / ГУ «Гематологический научный центр РАМН», 2009.

Приложение А1. Состав рабочей группы

Войцеховский В.В. врач , г Благовещенск

Вопилина Н.А. ГБУЗ «Тамбовская областная клиническая больница им. В.Д.Бабенко», г.Тамбов

Гапонова Т.В. к.м.н., заместитель генерального директора ФГБУ Гематологический Научный центр Минздрава России, Москва

Голубева М.Е . «Городской гематологический центр» при МБУЗ «ГКП № 5», г.Пермь

Капорская Т.С. к.м.н., заведующая отделением гематологии ГБУЗ Иркутская ордена "Знак Почета" областная клиническая больница, Иркутск,

Клясова Г.А. д.м.н., профессор, заведующая научно-клинической лабораторией микробиологии ФГБУ Гематологический Научный центр Минздрава России, Москва,

Константинова Т.С. заведующая отделением гематологии ГБУЗ СО Областной гематологический центр Свердловской областной клинической больницы №1, Екатеринбург,

Кулагин А.Д. д.м.н., заместитель главного врача по клинике ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова» Минздрава России г.Санкт-Петербург НИИ детской гематологии и трансплантологии им. Р.М.Горбачевой,

Лапин В.А. к.м.н., заведующий отделением гематологии ГБУЗ ЯО Областная клиническая больница, Ярославль

Михайлова Е.А. д.м.н., профессор, ведущий научный сотрудник отделения химиотерапии гемобластозов и депрессий кроветворения ФГБУ Гематологический Научный центр Минздрава России, Москва,

Паровичникова Е.Н. д.м.н., заведующая научно-клиническим отделом химиотерапии гемобластозов, депрессий кроветворения и трансплантации костного мозга ФГБУ Гематологический Научный центр Минздрава России, Москва,

Плоских М.А. ГБУЗ ПК «Пермская краевая клиническая больница», г.Пермь

Савченко В.Г. академик, д.м.н., профессор, Генеральный директор ФГБУ Гематологический Научный центр Минздрава России, Москва,

Самойлова О.С. к.м.н., заведующая отделение гематологии ГБУЗ Нижегородской области Нижегородская областная клиническая больница им. Н.А.Семашко, Нижний Новгород,

Скрипкина Н.С. врач-гематолог ГАУЗ АО «Амурская областная клиническая больница» , г Благовещенск,

Тикунова Т.С. ОГБУЗ «Белгородская областная клиническая больница Святителя Иоасафа», г.Белгород

Троицкая В.В. к.м.н., заведующая научно-клиническим отделением химиотерапии гемобластозов и депрессий кроветворения ФГБУ Гематологический Научный центр Минздрава России, Москва,

Устинова Е.Н. к.м.н., научный сотрудник отделения химиотерапии гемобластозов и депрессий кроветворения ФГБУ Гематологический Научный центр Минздрава России, Москва,

Чагорова Т.В. ГБУЗ «Областной онкологический диспансер», г.Пенза

Специалисты гематологи;

Специалисты онкологи;

Специалисты терапевты;

Методология сбора доказательств

Методы, использованные для сбора/селекции доказательств: поиск в электронных базах данных.

Описание методов, использованных для сбора/селекции доказательств:доказательной базой для рекомендаций являются публикации, вошедшие в Кохрайновскую библиотеку, базы данных ЕМВАSЕ и МЕDLINE. Глубина поиска составляла 10 лет.

Уровни доказательств	Описание
	Мета-анализы высокого качества, систематические обзоры рандомизированных контролируемых исследований (РКИ), или РКИ с очень низким риском систематических ошибок
	Качественно проведенные мета-анализы, систематические, или РКИ с низким риском систематических ошибок
	Мета-анализы, систематические, или РКИ с высоким риском систематических ошибок
	Высококачественные систематические обзоры исследований случай- контроль или когортных исследований. Высококачественные обзоры исследований случай-контроль или когортных исследований с очень низким риском эффектов смешивания или систематических ошибок и средней вероятностью причинной взаимосвязи
	Хорошо проведенные исследования случай-контроль или когортные исследования со средним риском эффектов смешивания или систематических ошибок и средней вероятностью причинной взаимосвязи
	исследования случай-контроль или когортные исследования с высоким риском эффектов смешивания или систематических ошибок и средней вероятностью причинной
	Не аналитические исследования (например: описания случаев, серий случаев
	Мнение экспертов

Методы, использованные для оценки качества и силы доказательств:

Консенсус экспертов;

Методы, использованные для анализа доказательств:

Систематические обзоры с таблицами доказательств.

Описание методов, использованных для анализа доказательств:

При отборе публикаций, как потенциальных источников доказательств, использованная в каждом исследовании методология изучается для того, чтобы убедиться в ее валидности. Результат изучения влияет на уровень доказательств, присваиваемый публикации, что в свою очередь влияет на силу, вытекающих из нее рекомендаций.

Методологическое изучение базируется на нескольких ключевых вопросах, которые сфокусированы на тех особенностях дизайна исследования, которые оказывают существенное влияние на валидность результатов и выводов.

На процессе оценки несомненно может сказываться и субъективный фактор. Для минимизации потенциальных ошибок каждое исследование оценивалось независимо, т.е. по меньшей мере двумя независимыми членами рабочей группы. Какие-либо различия в оценках обсуждались уже всей группой в полном составе. При невозможности достижения консенсуса, привлекался независимый эксперт.

Таблицы доказательств:

таблицы доказательств заполнялись членами рабочей группы.

Методы, использованные для формулирования рекомендаций:

консенсус экспертов.

Индикаторы доброкачественной практики (Good Ргасtic Points - GРРs):

Экономический анализ:

Анализ стоимости не проводился и публикации по фармакоэкономике не анализировались.

Внешняя экспертная оценка;

Внутренняя экспертная оценка.

	Описание
	По меньшей мере, один мета-анализ, систематический обзор, или РКИ, оцененные, как 1++ , напрямую применимые к целевой популяции и демонстрирующие устойчивость результатов или группа доказательств, включающая результаты исследований, оцененные, как 1+, напрямую применимые к целевой популяции и демонстрирующие общую устойчивость результатов
	группа доказательств, включающая результаты исследований, оцененные, как 2++, напрямую применимые к целевой популяции и демонстрирующие общую устойчивость результатов или экстраполированные доказательства из исследований, оцененных, как 1++ или 1+
	группа доказательств, включающая результаты исследований, оцененные, как 2+, напрямую применимые к целевой популяции и демонстрирующие общую устойчивость результатов; или экстраполированные доказательства из исследований, оцененных, как 2++
	Доказательства уровня 3 или 4; или экстраполированные доказательства из исследований, оцененных, как 2+

Настоящие рекомендации в предварительной версии были рецензированы независимыми экспертами, которых попросили прокомментировать прежде всего то, насколько интерпретация доказательств, лежащих в основе рекомендаций доступна для понимания.

Получены комментарии со стороны врачей первичного звена и участковых терапевтов в отношении доходчивости изложения рекомендаций и их оценки важности рекомендаций, как рабочего инструмента повседневной практики.

Предварительная версия была так же направлена рецензенту, не имеющему медицинского образования, для получения комментариев, с точки зрения перспектив пациентов.