Головокружение
IV. Лабораторная диагностика ВИЧ-инфекции

IV. Лабораторная диагностика ВИЧ-инфекции

В высокоспециализироваиной лаборатории проводятся:

А) определение циркулирующих в крови антител, антигенов и иммунных комплексов; культивирование вируса, выявление его геномного материала и ферментов;

Б) оценка функций клеточного звена иммунной системы. Основная роль принадлежит методам серологической диагностики, направленным на определение антител, а также антигенов возбудителя в крови и других биологических жидкостях организма.

Тестирование на антитела к ВИЧ осуществляют с целью:

А) безопасности гемотрансфузий и трансплантаций;

Б) эпиднадзора, тестирование в целях мониторинга превалентности ВИЧ-инфекции и изучения динамики ее распространенности в определенной популяции;

В) диагностики ВИЧ-инфекции, т. е. добровольное тестирование сыворотки крови практически здоровых людей или больных с различными клиническими признаками и симптомами, сходными с ВИЧ-инфекцией или СПИДом.

Система проведения лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции построена по трехэтапному принципу. Первый этап - скрининговый, предназначен для выполнения первичных исследований крови на наличие антител к белкам ВИЧ. Второй этап референтный - позволяет с помощью специальных методических приемов уточнить (подтвердить) первичный положительный результат, полученный на скрининговом этапе. Третий этан - экспертный, предназначен для окончательной проверки наличия и специфичности маркеров ВИЧ-инфекции, выявленных на предыдущих этапах лабораторной диагностики. Необходимость нескольких этапов лабораторной диагностики обусловлена прежде всего экономическими соображениями.

В практике применяется несколько тестов, позволяющих с достаточной степенью достоверности выявлять ВИЧ-инфицированных:

ИФА (ELISA)-тecт (твердофазный иммуноферментный анализ) выявления первого уровня, характеризуется большой чувствительностью, хотя и меньшей специфичностью перед нижеследующими;

Иммунный блот (Western-blot), весьма специфичный и наиболее используемый тест, позволяющий дифференцировать ВИЧ-1 и ВИЧ - 2;

Антигенемия р25-тест, эффективный в начальных стадиях заражения;

Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

В случаях массового скрининга образцов крови рекомендуется тестировать смеси сывороток от группы обследуемых, составленные с таким расчетом, чтобы конечное разведение каждого образца не превышало 1:100. Если смесь сывороток оказывается положительной, проводится исследование каждой сыворотки положительной смеси. Этот способ не ведет к потере чувствительности как в ИФА, так и в иммуноблоте, но снижает трудовые затраты и стоимость первичного обследования на 60-80%.

Иммунологические методы

1. количество Т хелперов,

2. соотношение Т4 иТ8,

3. состояние гиперчувствительности,

4. компенсаторная функция Т клеточной системы.

Проявляется гиперпродукцией иммуноглобулинов, они низко аффинны и материал организма расходуется еще больше.

Недостатки: проявляются поздно, некоторые иммунологические показатели могут быть при других инфекциях.

Клинические методы – м.б. сходны с другими заболеваниями, наиболее типичные проявления регистрируются на поздних стадиях, поэтому клиническая диагностика мало эффективна

Основной метод – серологический – реализуется в 2 этапа:

1 – скрининговое обследование – отбор проб к суммарным антителам ко всем белкам иммунного анализа. Этот этап дает 95% истинных результатов и 5% ложноположительных.

2 – подтверждающий метод – все пробы исследуют с помощью подтверждающего метода. Эта методика позволяет выявить антитела к вирусному белку. Положительный результат, когда обнаружены антитела не менее чем к 3 вирусным белкам, если к 1 или к 2 результат сомнительный и требует дополнительного обследования.

При первичной серодиагностике ВИЧ-инфекции проводится определение суммарных антител с помощью скрининговых отборочных тестов - ИФА и агглютинационных реакций. На втором (арбитражном) этапе используют более сложный тест - иммуноблот, позволяющий не только подтвердить или отклонить первоначальное заключение, но и сделать это на уровне определения антител к индивидуальным белкам вируса.

Интерпретация результатов анализа на антитела к ВИЧ

Достаточно большое количество различных факторов влияет на результат анализа на антитела к ВИЧ и среди них важное значение имеет время проведения анализа после возможного заражения.

В большинстве случаев антитела к ВИЧ можно обнаружить через 6–12 недель после заражения. Этот период от попадания вируса в организм до появления определяемого количества антител называется периодом положительной сероконверсии или периодом “окна”. Есть редкие случаи появления антител через 6 месяцев после заражения, а сообщения о выявлении антител только через 1 год не имеют доказательств. В настоящее время диагностическая служба использует новые генерации методов ИФА, которые позволяют выявить антитела к ВИЧ через 3–4 недели после заражения, а определенные комбинации этих методов, так называемые стратегии тестирования, сокращают период “окна” до 2–3 недель, т.е. дают возможность выявить антитела к ВИЧ как только они начинают вырабатываться в организме.

Отрицательный результат означает, что антитела к ВИЧ в крови обследуемого не обнаружены. Такое состояние называется серонегативностью и означает, как правило, что человек не заражен.

Отрицательный результат не дает никаких гарантий на будущее. Он констатирует только состояние в момент обследования. Существует незначительный шанс, что обследование проведено в период “окна”. Поэтому, если человек раньше рисковал заразиться ВИЧ и получил отрицательный результат тестирования, необходимо пройти повторное тестирование по крайней мере через 6 месяцев после рискованного события.

Положительный результат означает, что в крови обследуемого найдены антитела к ВИЧ. Такое состояние называется серопозитивностью – человек заражен ВИЧ. Важно понимать, что положительный результат свидетельствует только о ВИЧ-инфекции, а не о заболевании СПИДом. Тем не менее, крайне важно срезу по получению положительного результата обратиться ко врачу для получения консультаций и, если нужно, медицинской помощи, что позволит поддержать качество жизни на хорошем уровне длительное время.

Неопределенный результат. В редких случаях результат анализа на антитела к ВИЧ неясен. Лаборатория не может дать ответ серопозитивен человек или серонегативен. В таких обстоятельствах необходимо проконсультироваться с врачом, и еще раз пройти тестирование.

… диагностика любого инфекционного заболевания основана на сопоставлении эпидемиологических, клинических и лабораторных данных, и преувеличение значения одной из групп этих данных может привести к диагностическим ошибкам.

Диагностика ВИЧ-инфекции включает в себя два этапа :
I этап - установление собственно факта зараженности ВИЧ-инфекцией ;
II этап - определение стадии заболевания .

УСТАНОВЛЕНИЕ ФАКТА ЗАРАЖЕННОСТИ ВИЧ-ИНФЕКЦИЕЙ

Установление собственно факта зараженности ВИЧ-инфекцией (то есть выявление ВИЧ-инфицированных) в свою очередь также включает в себя два этапа :
I этап - иммуноферментный анализ (ИФА) : метод ИФА является скрининговым (отборочным) - отбор предположительно инфицированных лиц, то есть его целью является выявление подозрительных лиц и отсеивние здоровых лиц; антитела к ВИЧ выявляют с помощью других антител к искомым антителам (антитела против других антител). Эти «вспомогательные» антитела метят ферментом. Все скрининговые тесты обязаны быть высокочувствительными, чтобы не пропустить больного. Из-за этого их специфичность не очень высокая, то есть ИФА может дать положительный ответ («вероятно болен») у неинфицированных людей (например, у больных аутоиммунными заболеваниями: ревматизм, системная красная волчанка и др.). Частота ложноположительных результатов при использовании различных тест-систем колеблется от 0,02 до 0,5%. Если у человека ИФА дало положительный результат, то для подтверждения факта инфицирования ВИЧ необходимо обследоваться дальше. При проведении ИФА в 3 - 5% случаев возможны ложноотрицательные результаты - если инфицирование произошло относительно недавно и уровень антител еще очень низкий, или в терминальной стадии болезни, характеризующейся тяжелым поражением иммунной системы с глубоким нарушением процесса антителообразования. Поэтому при наличии данных, свидетельствующих о контакте с инфицированными ВИЧ обычно проводят повторные исследования через 2 - 3 месяца.
II этап - иммуноблоттинг (в модификации Western Blot, вестерн-блот) : является более сложным методом и служит для подтверждения факта инфицирования. Этот метод выявляет не комплексные антитела к ВИЧ, а антитела к отдельным его структурным белкам (p24, gp120, gp41 и др.). Результаты иммуноблоттинга считаются положительными, если выявляются антитела хотя бы к трем белкам, один из которых кодируется генами env , другой - генами gag , третий - генами pol . Если обнаруживаются антитела к одному или двум белкам, результат считается сомнительным и требует подтверждения. В большинстве лабораторий диагноз ВИЧ-инфекции ставится, если одновременно выявляются антитела к белкам р24 , р31 , gp4l и gpl20/gp160. Суть метода: вирус разрушают на компоненты (антигены), которые состоят из ионизированных аминокислотных остатков, а потому все компоненты имеют отличающийся друг от друга заря; затем с помощью электрофореза (электрического тока) антигены распределяются на поверхности полоски - если в исследуемой сыворотке есть антитела к ВИЧ, то они будут взаимодействовать со всеми группами антигенов, а это можно выявить.

Следует помнить , что антитела к ВИЧ появляются у 90-95% инфицированных в течение 3-х месяцев после заражения, у 5-9% инфицированных антитела к ВИЧ появляются через 6 месяцев и у 0,5-1 % инфицированных антитела к ВИЧ появляются в более поздние сроки. В стадии СПИДа количество антител может снижаться, вплоть до полного исчезновения.

В иммунологии существует такое понятие, как «серологическое окно» - период от инфицирования до появления такого количества антител, которое можно выявить. Для ВИЧ этот период обычно продолжается от 2 до 12 недель, в редких случаях дольше. В период «серологического окна» по анализам человек здоров, но на самом деле является зараженным ВИЧ. Установлено, что ДНК ВИЧ может находиться в геноме человека не менее трех лет без признаков активности и антитела к ВИЧ (маркеры ВИЧ-инфицирования) не появляются.

В данный период («серологическое окно») выявить ВИЧ-инфицированного и даже через 1-2 недели после заражения возможно с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Это чрезвычайно чувствительный метод - теоретически можно выявить 1 ДНК на 10 мл среды. Суть метода заключается в следующем: с помощью полимеразной цепной реакции получают много копий нуклеиновой кислоты (вирус является нуклеиновой кислотой -ДНК или РНК - в белковой оболочке), которые потом выявляют с помощью меченых ферментов или изотопов, а также по характерному строению. ПЦР является дорогостоящим методом диагностики, поэтому при скрининге и в плановом порядке не используется.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТАДИИ ЗАБОЛЕВАНИЯ

В основе развития СПИДа лежит , в первую очередь, разрушение Т-лимфоцитов-хелперов, маркируемых моноклональными антителами - кластерами дифференцировки – как CD4. В связи с этим проведение диагностики и наблюдение за прогрессированием заболевания невозможно без контроля субпопуляции Т-хелперов, который наиболее удобно осуществлять с помощью лазерного клеточного сортировщика.

При слабо выраженной ВИЧ-инфекции количество Т-лимфоцитов - чрезвычайно вариабельный показатель. В целом, снижение числа клеток CD4 (абсолютное и относительное) обнаруживается у лиц, ВИЧ-инфицирование которых произошло не менее года назад. С другой стороны, на ранних стадиях инфекции нередко оказывается резко повышенным число Т-супрессоры (CD8) как в периферической крови, так и в увеличенных лимфоузлах.

При выраженном СПИДе абсолютное большинство больных имеет сниженное общее число Т-лимфоцитов (менее 1000 в 1 мкл крови, в том числе лимфоцитов CD4 - менее чем 22 в 1 мкл, тогда как абсолютное значение содержания CD8 остаётся в пределах нормы). Соответственно, резко снижается соотношение CD4/ CD8. Ответ Т-лимфоцитов in vitro на стандартные антигены и митогены снижается в строгом соответствии с относительно сниженным числом CD4.

Для поздних стадии СПИДа характерны общая лимфопения, нейтропения, тромбоцитопения (соответственно, снижение числа лимфоцитов, нейтрофилов и тромбоцитов), анемия. Эти изменения могут быть следствием центрального угнетения кроветворения за счёт поражения кроветворных органов вирусом, а также - аутоиммунного разрушения клеточных субпопуляции на периферии. Кроме того, для СПИДа характерно умеренное увеличение количества гамма-глобулинов с доминирующим увеличением содержания IgG. Больные с выраженными симптомами СПИДа нередко имеют повышенный уровень IgA. На некоторых стадиях заболевания существенно повышается уровень таких маркёров СПИДа, как 1-микроглобулин, кислотостабильный -интерферон, 1-тимозин. То же происходит с секрецией свободного неоптерина - метаболита макрофагов. Пока не представляется возможным оценить относительную значимость каждого из перечисленных тестов, число которых постоянно возрастает. Поэтому их следует рассматривать во взаимодействии с маркёрами ВИЧ-инфекции как иммуновирусологического, так и цитологического характера. Для клинического анализа крови характерны лейкопения, лимфопения (соответственно, снижение числа лейкоцитов и лимфоцитов).

1 стадия - «стадия инкубации » - антитела к ВИЧ еще не выявляются; диагноз ВИЧ-инфекции на данной стадии ставится на основании эпидемиологических данных и лабораторно должен подтверждаться обнаружением в сыворотке крови пациента вируса иммунодефицита человека, его антигенов, нуклеиновых кислот ВИЧ;
2 стадия - «стадия первичных проявлений » - в данном периоде уже имеется выработка антител:;
2А стадия - «бессимптомная » - ВИЧ-инфекция проявляется только выработкой антител;
2Б стадия - «острая ВИЧ-инфекция без вторичных заболеваний » - в крови больных могут обнаруживаться широкоплазменные лимфоциты - «мононуклеары» и часто отмечается транзиторное снижение уровня СD4-лимфоцитов (острая клиническая инфекция отмечается у 50-90% инфицированных лиц в первые 3 месяца после заражения; начало периода острой инфекции, как правило, опережает сероконверсию, т.е. появление антител к ВИЧ);
2В стадия - «острая ВИЧ-инфекция с вторичными заболеваниями » - на фоне снижения уровня СD4-лимфоцитов и развившегося вследствие этого иммунодефицита появляются вторичные заболевания различной этиологии (ангина, бактериальная и пневмоцистная пневмония, кандидозы, герпетическия инфекция и др.);
3 стадия - «латентная » - в ответ на прогрессирование иммунодефицита происходит модификация иммунного ответа в виде избыточного воспроизводства СD4-клеток с последующим постепенным снижением уровня СD4-лимфоцитов, в среднем со скоростью 0,05-0,07x109/л в год; в крови обнаруживаются антитела к ВИЧ;
4 стадия - «стадия вторичных заболеваний » - истощение лимфоцитов популяции CD4, концентрация антител к вирусу значительно снижается (в зависимости от тяжести вторичных заболеваний выделяют стадии 4А, 4Б, 4В);
5 стадия - «терминальная стадия » - типично снижение количества СD4-клеток ниже 0,05x109/л; концентрация антител к вирусу значительно снижается или антитела могут не определяться.

/ 16
ХудшийЛучший

Обследованию на ВИЧ-инфекцию подлежат:

2. Лица с подозрением или подтвержденным диагнозом: бактериальной инфекции у детей младше 13 лет, множественной и рецидивирующей; кандидоза пищевода, трахеи, бронхов или легких; цервикального инвазивного рака; диссеминированного или внелегочного кокцидиомикоза; криптококкоза внелегочного; криптоспоридиоза с диареей в течение 1 мес и более; цитомегаловирусного поражения других органов, кроме печени, селезенки, лимфатических узлов у больных старше 1 мес; цитомегаловирусного ретинита с потерей зрения; герпетической инфекции, вызывающей многоочаговые язвы, которые не излечиваются на протяжении 1 мес, или бронхит, пневмонию, эзофагит; гистоплазмоза диссеминированного или внелегочного; изоспороза с диареей свыше 1 мес; туберкулеза распространенного или внелегочного; туберкулеза легких у взрослых или подростков старше 13 лет; туберкулеза внелегочного; другого заболевания, вызванного микобактериями, кроме М. tuberculosis диссеминированного или внелегочного; пневмонии, вызванной пневмоцистами; прогрессирующей многофокусной лейкоэнцефалопатии; сальмонеллезной (кроме Salmonella typhi) септицемии, рецидивирующей; токсоилаз-моза мозга у детей старше 1 мес; саркомы Капоши; лимфоидной интерстициальной пневмонии у детей младше 13 лет; лимфомы Беркитта; иммунобластной лимфомы; первичной лимфомы мозга; синдрома истощения, гепатита В, носительства HBsAg; инфекционного мононуклеоза; рецидивирующего опоясывающего герпеса у лиц старше 60 лет; болезней, передающихся половым путем.

В высокоспециализироваиной лаборатории проводятся:

а) определение циркулирующих в крови антител, антигенов и иммунных комплексов; культивирование вируса, выявление его геномного материала и ферментов;

б) оценка функций клеточного звена иммунной системы. Основная роль принадлежит методам серологической диагностики, направленным на определение антител, а также антигенов возбудителя в крови и других биологических жидкостях организма.

Тестирование на антитела к ВИЧ осуществляют с целью:

а) безопасности гемотрансфузий и трансплантаций;

б) эпиднадзора, тестирование в целях мониторинга превалентности ВИЧ-инфекции и изучения динамики ее распространенности в определенной популяции;

в) диагностики ВИЧ-инфекции, т. е. добровольное тестирование сыворотки крови практически здоровых людей или больных с различными клиническими признаками и симптомами, сходными с ВИЧ-инфекцией или СПИДом.

Антигенемия р25-тест, эффективный в начальных стадиях заражения;

Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

В случаях массового скрининга образцов крови рекомендуется тестировать смеси сывороток от группы обследуемых, составленные с таким расчетом, чтобы конечное разведение каждого образца не превышало 1:100. Если смесь сыворо-ток оказывается положительной, проводится исследование каждой сыворотки положительной смеси. Этот способ не ведет к потере чувствительности как в ИФА, так и в иммуноблоте, но снижает трудовые затраты и стоимость первичного обследования на 60-80%.

Иммуноферментный анализ (ИФА) является основным и наиболее широко применяемым методом определения антител к ВИЧ. Но к недостаткам применения ИФА в серодиагностике ВИЧ-инфекции следует отнести частые ложноположительные результаты. В связи с этим результат в ИФА не является основанием для заключения о ВИЧ-серопозитивности обследуемого. Это связано с недостаточной очисткой иммуносорбента от балластных белков; спонтанным связыванием антител сыворотки с пластиком, если его участки, не занятые иммуносорбентом, недостаточно блокированы или не блокированы совсем специальным нейтральным белком; перекрестным взаимодействием с ВИЧ-белками иммуносорбента различных протеинов, присутствующих в крови лиц с определенными, чаще аутоиммунными патологическими процессами типа рассеянного склероза, СКВ, туберкулеза; с частым донорством, инфекционными и онкозаболеваниями, ожогами, беременностью, повторными гемотрансфузиями, пересадкой органов, тканей, а также лиц, находящихся на гемодиализе; с присутствием в крови ревматоидного фактора, часто провоцирующего ВИЧ-ложноположительные реакции; наличием в крови обследуемых людей антител к gag-белкам ВИЧ и прежде всего к белку р24 (очевидно, образуются антитела к экзо-или эндогенным не идентифицированным еще ретровирусам). Так как анти-р24 синтезируются в обязательном порядке на ранних стадиях ВИЧ-сероконверсии, проводится дальнейшее иммунологическое наблюдение за лицами с антителами к gag-белкам ВИЧ, а также отстранение их от донорства.

Чувствительность и специфичность иммуноферментно-го анализа постоянно повышаются. В результате ИФА четвертого поколения не уступают по своим диагностическим возможностям иммунному блотингу и могут быть использованы не только на скрининговом, но и на подтверждающем этапе диагностики ВИЧ-инфекции [Смольская Т. Т., 1997].

Иммуноблотинг является конечным методом серологической диагностики, позволяющим сделать окончательное заключение о ВИЧ-позитивности или негативности обследуемого.

Существует четкая корреляция между результатами исследования сывороток в иммуноблоте и ИФА - дважды положительные в ИФА с разными тест-системами сыворотки в 97-98% случаев оказываются затем ВИЧ-позитивными в иммуноблотинге. Если же сыворотки оказались положительными в ИФА лишь в одной из двух использованных тест-систем, в иммуноблоте они выявляются положительными лишь в 4% случаев. В 5% случаев при проведении подтверждающих исследований у лиц с положительными данными ИФА-иммуноблот может давать «неопределенные» результаты, а среди них примерно в 20% случаев «неопределенные» результаты вызывают антитела к gag-белкам ВИЧ-1 (р55, р25, р18). Наличие антител только к gag-белкам ВИЧ-1 является поводом для дополнительного обследования сыворотки крови на инфицирование ВИЧ-2.

Оценка результатов иммуноблотинга осуществляется строго в соответствии с прилагаемой к тест-системе инструкцией. В случае отсутствия в инструкции указаний по интерпретации результатов следует использовать критерии ВОЗ.

При получении положительных результатов исследований на референтном этапе лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции и отрицательном результате исследования методом иммунного блотинга проводится обязательная повторная экспертная диагностика через 6 мес после первого обследования.

Если результаты иммуноблотинга через 12 мес после исследования первой пробы остаются отрицательными или неопределенными, то при отсутствии факторов риска, клинических симптомов или других факторов, связанных с ВИЧ-инфицированием, обследуемого снимают с диспансерного наблюдения.

Среди серологических методов в случае неопределенных результатов иммуноблота используется в качестве экспертной диагностики радиоиммунопреципитация (РИП). В основе ее лежит использование белков вируса, меченных радиоактивным йодом, а преципитаты выявляются с помощью бета-счетчиков. К недостаткам метода относится дороговизна аппаратуры, необходимость оборудования для этих целей специальных помещений.

Лица, у которых диагностирована ВИЧ-инфекция, подлежат постоянному динамическому наблюдению с обязательным лабораторным обследованием каждые 6 мес.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) выявляет предварительно умноженные нуклеотидные последовательнос-ти, специфичные для генома данного возбудителя. Изолированное умножение гена или его фрагмента, называемое амплификацией, ПЦР дает возможность осуществлять в пробирке при помощи фермента термостабильной ДНК-полимеразы. За 2-3 часа ПЦР позволяет получить миллионы копий специфического участка вируса. При ВИЧ-инфекции из клеточной РНК, включающей и РНК вируса, если он репродуцировался в клетке или был интегрирован в ее геном, с помощью обратной транскрипции и гибридизации с мечеными олигонуклеотидными «зондами» получают достаточное для анализа количество провирусной ДНК, которую выявляют и характеризуют количественно, как и в отношении принадлежности к геному ВИЧ, по радиоактивной или иной метке зонда устанавливая гомологию ДНК и специфических для вируса аминокислотных последовательностей. Чувствительность ПЦР - обнаружение вирусных генов в одной из пяти тысяч клеток.

ПЦР, в том числе количественная, может быть исполь-зовна только в целях определения вирусной нагрузки на плазму для решения вопроса начала медикаментозного лечения больного или смены антиретровирусных лекарственных препаратов. ПЦР не может быть рекомендована для постановки диагноза ВИЧ-инфекции, так как даже самые ультрасовременные методы ее постановки и реактивы позволяют определить вирусную нагрузку не ниже определенного уровня - 50 копий/мл. А сложность постановки ПЦР и ее дороговизна (около 200 долларов) сводят на нет ее широкомасштабное использование как метода повседневной лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции. Таким образом, ПЦР остается незаменимой только для оценки вирусной нагрузки на плазму у больных с уже установленным диагнозом ВИЧ-инфекции в целях решения вопроса терапии больных.

Схематично этапы лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции представлены на рис. 1.

Рис. 1. Этапы лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции

В течение ВИЧ-инфекции существует период «темного лабораторного окна», когда количество антител против ВИЧ является недостаточным для чувствительности тест-систем. Период этот колеблется от одной недели до трех месяцев от момента заражения ВИЧ в зависимости от уровня чувствительности тест-системы. С учетом этого явления возникают сложности при обследовании донорской крови от лиц, пребывающих в упомянутом периоде ВИЧ-инфицирования. Поэтому в большинстве стран мира введена система использования крови только после ее хранения на протяжении 3-6 мес с целью осуществления обязательного повторного обследования на ВИЧ-инфекцию доноров данных доз крови и ее компонентов.

Стадия первичных проявлений характеризуется активностью репликативного процесса. Возникающие виремия и антигенемия вызывают образование специфических антител класса IgM: анти-р24, aнти-gp41, aнти-gp120. Антиген р24 у части инфицированных может быть выявлен в крови методом ИФА уже через 2 нед после заражения и определяться до 8-н недели. Далее в клиническом течении ВИЧ-инфекции отмечается второй подъем содержания в крови белка р24, он приходится на период формирования стадии СПИД.

Появление полной сероконверсии, когда в периферической крови регистрируется высокий уровень специфических антител класса IgG к структурным белкам ВИЧ gp41, р24, gpl20, существенно облегчает диагностику ВИЧ-инфекции. Большинство коммерческих наборов рассчитано на индикацию именно таких антител.

Трудности с выявлением антител у больных ВИЧ-инфекцией могут возникнуть в периоды массивной виремии и антигенемии, когда имеющиеся специфические антитела в крови израсходованы на связывание вирусных частиц, и репликативный процесс опережает наработку новых противовирусных антител.

У лиц с исходно ослабленной иммунной системой виремия и антигенемия появляются раньше и сохраняются на высоком уровне до исхода заболевания. Вместе с тем у таких больных отмечается низкое содержание свободных антител к ВИЧ, обусловленное двумя причинами - недостаточной продукцией антител В-лимфоцитами и связыванием антителами вирионов и растворимых белков ВИЧ, поэтому для определения инфицированности требуются тест-системы с повышенной чувствительностью или модификации методов анализа, предусматривающие этап высвобождения антител из иммунных комплексов.

Несмотря на обилие специфических маркеров ВИЧ-инфекции, наиболее часто определяемым является наличие суммарных антител к белкам ВИЧ. Термин «суммарный» подразумевает присутствие двух классов антител (IgG и IgM) и широкий спектр антител к различным, в первую очередь к структурным, белкам ВИЧ.

Определение СD4-клеток. Основным клинико-лабораторным показателем диагностики стадии ВИЧ-инфекции, степени разрушения иммунной системы у больных в повседневной жизни стало определение содержания CD4+-лимфоцитов: уменьшение уровня ниже 200 клеток/мм3 является основным критерием постановки диагноза СПИД. Считается, что все ВИЧ-инфицированные лица с количеством CD4+-лимфоцитов 200 клеток/мм3 и ниже нуждаются как в противовирусной терапии, так и профилактике пневмоцистной пневмонии. И хотя у 1/3 ВИЧ-инфицированных с количеством С04+-лимфоцитов менее 200 клеток/мм3 отсутствуют клинические проявления, опыт показал, что у них симптомы развиваются в ближайшие 2 мес, поэтому они все расцениваются как больные на стадии СПИДа.

При диагностике ВИЧ-инфекции используется 4 группы методов:

1. Определение наличия вируса, его антигенов или копий РНК в материалах от больного или ВИЧ-инфицированного

2. Серологическая диагностика, основанная на выявлении специфических антител к поверхностным (gp 120 и gp 41) и внутренним (р 18 и р 24) белкам ВИЧ.

3. Выявление патогномоничнъгх (специфических) для ВИЧ-инфекции изменений в иммунной системе.

4. Лабораторная диагностика оппортунистических инфекций (СПИД-ассоциированных заболеваний).

1. Вирусологическая диагностика. Материалом для выделения ВИЧ являются Т-лимфоциты крови, лейкоциты костного мозга, лимфатические узлы, ткани мозга, слюна, сперма, спинномозговая жидкость, плазма крови. Полученным материалом заражают перевиваемую культуру Т-лимфоцитов (Н9). Индикацию ВИЧ в культуре клеток проводят по ЦПД (образование симпла-стов), а также методами иммунофлюоресценции, электронной микроскопии, по выраженной активности обратной транскриптазы. Современные методы исследования позволяют обнаружить один инфицированный лимфоцит на 1000 клеток.

Выявление вирусных антигенов в инфицированных Т-лимфоцитах осуществляют с помощью моноклональнъгх антител

В последние годы решающее значение для определения прогноза и тяжести ВИЧ-инфекции имеет определение количества копий РНК ВИЧ в плазме крови методом полимеразной цепной реакции (ТТЦР) - так называемая вирусная нагрузка. Если у пациентов, не получающих терапии, вирусная нагрузка находится ниже предела определения (это менее 5000 копий РНК ВИЧ в I мл плазмы), это свидетельствует об отсутствии прогрессирования или о медленном прогресси-ровании. Степень заразности при этом минимальная. Высокая вирусная нагрузка (более 10000 копий РНК в 1 мл плазмы) у пациентов с числом СО4-лимфоцитов менее 300 в 1 мкл всегда свидетельствует о прогрессировании болезни.

2. Серологическая диагностика. В настоящее время получила наибольшее распространение.

Материал для исследовать: 5 мл. гепаринизированной крови, которую до доставки в лабораторию можно хранить 6-8 часов в охлажденном, но не в замороженном состоянии.

С целью серологической диагностики СПИДа используют прежде всего методы иммуноферментного анализа со стандартными иммуноферментными системами (ИФА). Это скрининговый метод. Принцип работы основан на классическом принципе прямого ИФА. Иммуносорбентом являются полистироловые планшеты с иммобилизированным инактивированным вирусспецифиче-ским антигеном, полученным из ВИЧ, либо синтетическим путем. Затем вносят испытуемую сыворотку в разведении. Проводят инкубацию в лунках с антигеном. После связывания АГ с AT следует трехкратное отмывание несвязавшихся белков, а после этого в лунки вносят коньюгат антител к иммуноглобулинам человека с ферментной меткой. Образование специфического комплекса АГ+АТ выявляют внесением субстрата для фермента (раствор ортофенилендиамина и перекиси водорода). В результате окраска среды меняется пропорционально количеству антител. Результаты исследования учитывают на спектрофотометре. Сыворотки крови, имеющие вирусспецифические антитела по данным ИФА, в дальнейшем необходимо исследовать методом иммунного блотинга.

Иммунный блотипг является подтверждающим тестом, так как позволяет выявить антитела к различным белкам ВИЧ. Он основан на предварительном фракционировании по молекулярной массе (разделении) белков ВИЧ электрофорезом в полиакриламидном геле с последующим перенесением антигенов на мембрану из нитроцеллюлозы. Затем на мембрану наносится испытуемая сыворотка. При этом специфические антитела образуют комплекс с конкретным АГ (gp.120, gp.41, p.24, p.18). Заключительный этап исследования - выявление антител к различным белкам ВИЧ. Для этого в систему добавляют антитела против белков человека, меченые ферментом или радиоизотопной меткой. Таким образом, в сыворотке пациента выявляют (либо не выявляют) вирусспецифические антитела ко всем или большинству антигенов ВИЧ.

3. Исследования иммунного статуса. Направлены на выявление:

1) уменьшения соотношения CD4/CD8 клеток (в N 2 и >, при СПИДе - 0,5 и <);

2) снижения содержания CD4 клеток (<200 клеток/мл.);

3) наличия одного из лабораторных признаков, включающих анемию, лейкопению, тромбошггопению, лимфопению;

4) повышения концентрации Ig А и Ig G в сыворотке крови;

5) снижения реакции бластгрансформации лимфоцитов на митогены;

6) отсутствие кожной реакции ГТЗ на несколько антигенов;

7) повышение уровня циркулирующих иммунных комплексов.