К ним относят и те гены-супрессоры, продукты которых не входят в системы репарации ДНК непосредственно, а принимают участие в организации "контрольного пункта" проверки ДНК перед переходом клетки к следующей стадии клеточного цикла, обеспечивающего две основных контролирующих функции:

Проверку того, что предыдущая стадия завершена полностью, и

В случае необходимости создания возможности для прохождения репарации ДНК перед началом репликации. В частности, это означает, что разрывы в цепи ДНК приводят к задержке клеточного цикла в фазе G1, препятствуя переходу клетки в фазу S. Ключевую роль в этом процессе играет один известный ген-супрессор - p53, мутации или делеции которого наблюдали примерно в 50% всех злокачественных заболеваний.

Ген р53 является центральным компонентом системы, обеспечивающего удаление из организма патологических клеток . Многочисленные сигнальные пути отслеживают состояние клетки и в случае возникновения повреждений или сбоев, угрожающих приобретением наследственных изменений, вызывают активацию белка р53 , который либо координирует процесс репарации , либо индуцирует самоубийство клетки .

Ген р53 играет роль верховного судьи, который решает судьбу клеток и гарантирует их социальное поведение. Утрата гена р53 приводит к бесконтрольному накоплению генетических повреждений, приводящих к потере контроля со стороны организма, злокачественному росту клеток и смерти.

Белок p53 массой 53Кда является фосфопротеином и состоит из 393 аминокислот. Белок р53, функционирующий в виде тетрамера, связывается с убиквитином (Ub) при участии фактора MDM2 (murine double minute 2) и подвергается деградации. Белок р19/ARF , экспрессия которого увеличивается действием онкостимулов типа E1a, V-abl, myc, нарушает это связывание и предотвращает деградацию р53. Также ингибитором этого связывания является продукт гена AТМ , повреждения которого вызывают атаксию-телангиоэктазию . Белок p53 способен функционировать также как активатор транскрипции.

Ген-супрессор, кодирующий белок р53 экспрессируется практически во всех типах опухолей. Впервые он был обнаружен в комплексе с Т-антигеном вируса SV40 в клетках, трансформированных этим вирусом [ Lane DP., Crawford L.V., 1979 , Levine A.J., 1990 ], и первоначально был отнесен к семейству онкогенов. Он также был картирован (в 17р13), клонирован и секвенирован [ Alhor ea 1994 , Lamb P., Crawford L., 1986 ]. В генах, выделенных из различных опухолей, обнаружены все типы мутаций, но превалируют точковые мутации, локализованные в экзонах 5-8 [ Hollstein ea 1991 , Kupryjanczyk J., ea, 1993 ]. Как и при анализе гена Rb, бесспорным доказательством его супрессорной активности послужили результаты опытов по трансфекции нормального аллеля гена р53 в злокачественные клетки, которые теряли признаки трансформированного фенотипа под его влиянием. По некоторым особенностям поведения р53 отличается от других генов-супрессоров. Поэтому Вейнбергом он был назван "нарушителем правил" [ Weinberg ea 1984 ]. Оказалось, что для подавления супрессорной активности необязательна гомозиготность по мутантным аллелям р53, которая характерна для рецессивных мутаций. В некоторых случаях р53 может терять супрессорную активность в гетерозиготном состоянии. Это объясняется способностью р53 при трансляции образовывать комплексы, в которые могут входить как мутантные, так и нормальные белки, при этом приобретаюие "мутантную" конформацию [

Белок p53, антитела IgG (количественное определение). Anti-p53-Ab

Показатель	Характеристика
Материал	Венозная кровь
Правила подготовки пациента	Стандартные, см. раздел № 15
Транспортная среда, пробирка
	Стандартные, см. раздел № 17
Метод тестирования
Анализатор и тест - система
Референтные значения , E д/мл

Описание:

Антигеном для данных антител является белок p53, осуществляющий контроль над течением процессов клеточного цикла, а также за наличием в геноме повреждений, которые могли бы привести к дальнейшему развитию патологии. p53-зависимый апоптоз - мощный селектор, позволяющий избежать накопления мутаций, а в случае, когда они уже возникли, p53-зависимый апоптоз позволяет элиминировать такие потенциально опасные для организма клетки.

Ген-супрессор опухолевого роста, мутации в котором обнаруживаются в 50% случаев заболевания раком всех типов. Этот ген кодирует транскрипционный фактор, контролирующий вхождение клетки в клеточный цикл. Многие внутриклеточные системы, следящие за «здоровьем» клетки, передают сигналы о «неполадках» белку р53. С его помощью клетка принимает решение, делиться или не делиться. Если клетка несёт неисправимые повреждения, белок р53 запускает цепь событий, приводящих к «самоубийству» клетки, иначе называемому апоптозом. Клетки, в которых нет р53 или в которых он неправильно функционирует, не способны к подобному самоконтролю и продолжают делиться, даже когда это становится опасным для организма. Как и все супрессоры опухолевого роста, р53 контролирует нормальное протекание клеточного цикла.

Согласно исследованиям последних 5 лет, наиболее актуальным является контроль данного показателя при таких состояниях, как онкологические заболевания (рак яичников, немелкоклеточный рак легких и др.), ГЭРБ, ЯБЖ, ЯБДПК, хронический гастрит типа В.

Показатель	Характеристика
Материал	Венозная кровь
Правила подготовки пациента	Стандартные, см. раздел № 15
Транспортная среда, пробирка	Вакутайнер с/без антикоагулянта с/без гелевой фазы
Правила и условия транспортировки, стабильность пробы	Стандартные, см. раздел № 17
Метод тестирования
Анализатор и тест - система	Photometer Fa. Tecan; Fa. Dianova
Референтные значения , E д/мл

Как подготовиться к анализу:

Анализ крови

Для исключения факторов, которые могут влиять на результаты исследования, необходимо придерживаться следующих правил подготовки:

• кровь для исследования сдается только натощак!
• перед сдачей венозной крови желательно 15 мин.отдых;
• за 12 часов до исследования следует исключить прием алкоголя, курение, прием пищи, ограничить физическую активность;
• исключить прием лекарств. Если отменить прием лекарств невозможно, необходимо проинформировать об этом лабораторию;
• детей до 5 лет, перед сдачей крови, обязательно поить кипяченной водой (порциями, до 150-200 ml, на протяжении 30 минут)

Услуга временно недоступна

Белок р53 является продуктом гена-супрессора опухоли р53 и экспрессируется во всех клетках организма. При отсутствии повреждений
генетического аппарата белок р53 находится в неактивном состоянии, а
при появлении повреждений ДНК активируется. Активация состоит в
приобретении способности связываться с ДНК и активировать транскрипцию генов, которые содержат в регуляторной области
нуклеотидную последовательность, которая обозначается p53-response
element (участок ДНК, с которым связывается белок р53). Таким образом,
р53 - фактор, который запускает транскрипцию группы генов и который
активируется при накоплении повреждений ДНК . Результатом активации р53 является остановка клеточного цикла и репликации ДНК; при сильном стрессовом сигнале - запуск апоптоза.

Белок р53 активируется при повреждениях генетического аппарата, а также при стимулах, которые могут привести к подобным повреждениям, или являются сигналом о неблагоприятном состоянии клетки (стрессовом состоянии). Функция белка р53 состоит в удалении из пула
реплицирующихся клеток тех клеток, которые являются потенциально онкогенными (отсюда образное название белка р53 - англ. guardian of the genome - хранитель генома). Данное представление подтверждается тем фактом, что потеря функции белка р53 может быть установлена в ~50 % случаев злокачественных опухолей человека. В регуляции активности белка р53 ведущая роль принадлежит посттрансляционным модификациям белка и его взаимодействиям с другими белками.

p53 обеспечивает альтруистическое поведение клеток многоклеточного организма

Благодаря активности р53 клеткам многоклеточного организма свойственно альтруистическое поведение, при котором ослабленные и поврежденные клетки сами жертвуют собой, не вступая в конкурентные взаимоотношения с окружающими более здоровыми клетками. В результате строгого соблюдения запрета на конкуренцию между клетками становится невозможным генетический отбор, который позволил бы выживать и давать потомство наиболее приспособленным к тому или иному условию мутантным вариантам клеток. Функция р53, таким образом, обеспечивает генетическую стабильность , генетическую однородность соматических клеток.

Белковая молекула р53 имеет характерное для транскрипционного фактора строение и состоит из доменов, определяющих способность к узнаванию и связыванию со специфическими последовательностями
ДНК, а также к взаимодействию с компонентами транскрипционной
машины и ее активации. Связываясь с регуляторными участками
определенных генов, р53 обычно вызывает их активацию, хотя некоторые гены он, напротив, репрессирует, используя для репрессии
несколько альтернативных механизмов. Описано несколько транскрипционно-независимых функций р53 (например, способность транслоцироваться в митохондрии и оказывать про-апоптозное действие, способность непосредственно участвовать в репарации повреждений ДНК), функциональная направленность которых также хорошо соответствует стратегии р53 на обеспечение генетической стабильности.

При превышении физиологически допустимого уровня повреждений
задачей р53 становится избавление от генетически опасных дефектных клеток, что достигается либо путем активации апоптоза, либо за счет терминального выхода клеток из процесса деления, что является формой генетической смерти.

Регуляция активности p53

Инициаторами разрушения р53 в системе 26S протеасом служат несколько убиквитиновых лигаз типа Е3 . Наиболее изученной среди них является убиквитиновая лигаза Mdm2, которая сама является продуктом гена, активируемого р53 (Haupt et al. , 1997). В результате, повышение активности р53 приводит к индукции Mdm2, и, соответственно, к усилению разрушения р53 в 26S протеасомах. Недавно установлено участие других убиквитин-лигаз типа Е3 (Cop1, Pirh2 , ARF-BP/MULE , CHIP) в регуляции уровней р53, причем две из них (Cop1 и Pirh2), подобно белку Mdm2, выступают в качестве транскрипционных мишеней и, таким образом, вместе с р53 образуют обратные регуляторные связи.

Разрушение р53 может осуществляться также по убиквитин‑независимому пути, в 20S протеасомах (Asher, G., Shaul, Y., 2005). Этот путь быстрого разрушения характерен для белков, имеющих выраженные неструктурированные участки, в частности, он реализуется при разрушении денатурированных белков. Белковая молекула р53 имеет неструктурированные участки в N- и С-концевых областях, что обуславливает ее разрушение в 20S протеасомах.

Важным компонентом регуляции активности Mdm2 служит близкородственный белок MdmX , который имеет очень сходное строение, но в отличие от Mdm2 не обладает Е3 убиквитин-лигазной активностью (Jackson, M.W., Berberich, S.J., 2000). Белок MdmX связывается с N-концевой областью р53, подавляет его транскрипционную активность, но не вызывает его разрушения. Он также способен гетеро-олигомеризоваться с Mdm2 (Sharp et al. , 1999), что с одной стороны, приводит к стабилизации Mdm2, а с другой – к ускорению разрушения MdmX. Таким образом, изменения соотношений этих двух белков может тонко регулировать количество и активность р53.

Передача сигналов на p53

Описан целый ряд состояний, в которых активируется р53. К ним относится истощение запасов нуклеотидов, нарушения цитоскелета (нарушения полимеризации актиновых волокон, деполимеризация микротрубочек), нарушения биогенеза рибосом, состояние гипоксии и ишемии, состояние гипероксии, отсутствие или избыток некоторых ростовых факторов или цитокинов, нарушения клеточной адгезии и фокальных контактов , дефектные интегрины , нарушение прикрепления клеток к субстрату, появление полиплоидных клеток, образование микроядер, разрушение хромосомного веретена, гипер- и гипотермия, действие окиси азота (NO) и многое другое.

В настоящее время наиболее изученным является процесс индукции
р53 при повреждениях ДНК. В качестве примера механизма индукции р53 можно рассмотреть состояния, вызванные действием двух типов излучения – гамма радиации и ультрафиолета. Если в первом случае происходит более или менее «чистое» повреждение, с образованием разрыва цепи ДНК, то во втором наблюдаются сшивки ДНК, вызванные димерами тимина.

Действуя на митохондриальный путь, р53 репрессирует транскрипцию анти-апоптозного белка Bcl2 и активирует транскрипцию про-апоптозных белков Bax, Noxa, p53AIP1 и Puma. Кроме того, р53 активирует транскрипцию гена APAF1, повышает чувствительность клеток к внешним про-апоптозным лигандам, стимулируя транскрипцию генов FAS (APO1) и KILLER/DR5. Белок р53 индуцирует также множество других белков, связанных с индукцией апоптоза. Существует также значительная группа р53-индуцируемых генов, функция которых связана с изменением редокс баланса клетки. Согласно одной из моделей, резкое повышение уровня внутриклеточных кислородных радикалов, происходящее при индукции данной группы генов может способствовать ускорению клеточной смерти.

Недавно появились сообщения о принципиально новой стратегии р53 в отношении индукции клеточной смерти, которая включает транскрипционную активацию гена, кодирующего микроРНК. МикроРНК представляют собой короткие шпилечные нетранслируемые РНК, которые взаимодействуют с определенными мРНК, к которым они имеют сродство, вызывая подавление их функции. Активируемая р53 микроРНК miR34 также способна влиять на экспрессию ряда генов, хотя точные мишени ее пока неясны. Само по себе введение конструкций, экспресирующих miR34 вызывает остановку делений и апоптоз.

В процессе трансформации под действием онкогена Ras наблюдается значительное повышение уровня кислородных радикалов. Это повышение приводит к индукции р53, что сопровождается апоптозом или необратимой задержкой клеточного деления. В случае поломок р53-зависимых механизмов ограничение роста клеток, экспрессирующих онкоген Ras, не происходит, а увеличенный уровень кислородных радикалов ускоряет мутагенез, приводя к дальнейшему развитию опухолевого процесса (Kopnin et al. , 2007). Таким образом, антиоксидантная активность р53 является важной составляющей его функции, направленной на предотвращение развития опухолей.

Митохондриальная функция p53

Белок р53 способен не только активировать гены, участвующие в индукции клеточной смерти за счет своей транскрипционной функции,
но и принимает непосредственное участие в индукции митохондриального пути клеточной смерти (Erster et al. , 2004). После активации р53 под действием всевозможных стрессов часть р53 поступает в митохондрии, где он вступает во взаимодействие с анти- и про-апоптозными белками Bcl‑семейства (BclXL/Bcl2 и Bak , соответственно). Эти взаимодействия приводят к нарушению проницаемости наружной митохондриальной мембраны, утечке цитохрома С и индукции апоптоза.

Поступление р53 в митохондрии регулируется за счет убиквитинирования: его полиубиквитинированные формы поступают в 26S протеасомы, где подвергаются разрушению, а моноубиквитинированные – идут в митохондрии. В митохондрии р53 поступает из цитоплазмы, минуя вхождение в ядро. Под влиянием стрессов стабилизированный р53 поступает либо в ядро, где участвует в транскрипционной регуляции, либо сразу в митохондрии. Белок Mdm2 сам по себе не участвует в транспорте р53 в митохондрии, но его фоновая активность обеспечивает моноубиквитинирование, необходимое для транслокации в митохондрии. Возможно также участие других Е3 лигаз в моноубиквитинировании р53. В митохондриях р53 подвергается быстрому ферментативному деубиквитинированию под действием митохондриального HAUSP и превращению в активную форму. р53 вступает во взаимодействие с BH4 доменом анти-апоптозных белков BclXL и Bcl2, причем взаимодействующий участок р53 соответствует ДНК-связывающему домену. Связывание с анти-апоптозными белками высвобождает и активирует про-апоптозные
белки Bax и Bid. Активация белка Bax под действием цитоплазматического р53 происходит за счет перестройки конформации и олигомеризации, что способствует перемещению цитозольного Bax в митохондрии. Кроме того, связываясь в митохондриях с белком Bak белок р53 непосредственно стимулирует его олигомеризацию и активацию, а также вытесняет его из комплекса с анти-апоптозным белком Mcl-1 (Leu, J.I. et al. , 2004). Все эти взаимодействия вызывают выброс цитохрома С и индукцию апоптоза даже без транскрипционной активации про-апоптозных генов-мишеней р53.

Интересно, что полиморфный вариант р53 Arg72 обладает значительно большей способностью к митохондриальной транслокации по сравнению с Pro72 р53, и это коррелирует с различиями их про-апоптозной активности (Dumont et al. , 2003). Прямая индукция апоптоза под действием р53, по-видимому, является первой и очень быстрой реакцией на массивные повреждения. Вторая волна индукции апоптоза отмечается только через 6–7 часов, и она связана с транскрипционной активностью р53 в ядре. Присутствие р53 в цитоплазме сенсибилизирует клетки к продуктам р53-регулируемых генов PUMA и NOXA. Белок Puma очень эффективно вытесняет р53 из комплекса с BclXL, и освободившийся р53 активирует про-апоптозную функцию белка Bax. Кроме того, более активный белок Puma вытесняет из комплексов с BclXL менее активные про-апоптозные белки Bim и Bid , что повышает эффективность индукции апоптоза. Таким образом, действуя сразу на нескольких уровнях и путем использования совершенно разных механизмов, р53 осуществляет как быстрые реакции на сильные стрессы, так и реализует замедленную, но очень эффективную программу апоптоза поврежденных клеток.

p53 и старение

Будучи центром контроля правильности выполнения генетических программ, р53 неминуемо должен иметь отношения и к процессам
старения организма. До сих пор неясно, является ли процесс старения организма непосредственно запрограммированным процессом, или он ускоряется после прекращения действия программ регенерации и репарации организма по достижении определенного возраста. Известны значительные отклонения в продолжительности жизни организмов в пределах одного вида, причем имеются веские аргументы в пользу наследуемости признака долголетия. Поэтому наследственность можно рассматривать как первый из факторов, определяющих продолжительность жизни. Вторым фактором, безусловно, является образ жизни, поскольку существует множество указаний влияния образа жизни на ее продолжительность (Depp et al. , 2007). Наиболее обоснованным и достоверным представляется вывод о роли ограничения калорийности питания в увеличении продолжительности жизни (Guarente, L., 2005). Достаточно аргументированным является также представление о роли окислительных процессов в развитии процессов старения.

Существующие в настоящее время представления о роли р53 в старении весьма противоречивы. Генетические манипуляции с геном р53 на мышах дают весьма неоднозначные результаты. Изучение старения на модели мышей, лишенных р53 невозможно, поскольку эти мыши не доживают до одного года, погибая от злокачественных лимфом. Пересадка мышам частично активированного гена р53 приводит к существенному уменьшению частоты спонтанных опухолей, однако при этом наблюдается феномен преждевременного старения. В то же время, введение в геном мышей дополнительной копии немодифицированного гена р53 (Garcia-Cao et al. , 2002), или снижение экспрессии гена Mdm2 (Mendrysa et al. , 2006) приводит к защите от развития рака без снижения продолжительности жизни.

Каким же образом можно объяснить этот парадокс и существуют ли способы преодоления негативного действия р53? Для того чтобы найти ответ на этот вопрос надо вспомнить, что определяет проявление двух противоположных свойств р53. Низкие уровни р53 способствуют
оптимальной сбалансированности процессов, снижению риска возникновения мутаций и повышению скорости процессов репарации.
Очевидно, что это свойство р53 благоприятно как в плане профилактики рака, так и в замедлении процессов старения. Продление жизни организмов путем ограничения потребления калорий, вероятно, также не обходится без участия р53, поскольку при физиологически допустимом уровне р53 тормозится модуль IGFmTOR, а дефицит глюкозы способствует адаптивному повышению активности р53, посредством стимуляции АМР-зависимой киназы AMPK. Полезную роль может играть также активация аутофагии, в частности, с участием контролируемого р53 гена DRAM . В процессе аутофагии происходит омоложение цитоплазмы клеток. Это осуществляется за счет переваривания в лизосомах накапливающихся в цитоплазме поврежденных белков, характерных для стареющих клеток (например липофуксина), а также за счет преимущественного удаления поврежденных митохондрий, выделяющих повышенные количества кислородных радикалов (Terman et al., 2007). При низком уровне р53 его антиоксидантная функция дополнительно снижает риск накопления мутаций. Она оберегает организм от преждевременной выработки ресурса, поскольку постоянно высокий уровень кислородных радикалов приводит к ускоренной эрозии теломер, которые при каждом делении укорачиваются протяженными блоками (Saretzki, G., Von Zglinicki, T., 2002). Таким образом, при умеренном образе жизни активность гена р53 направлена как против риска возникновения рака, так и против преждевременного старения.

Другое проявление активности р53 связано с вынужденными радикальными мерами, к которым организму приходится прибегать при серьезных стрессах, интоксикациях, облучении, инфекциях и воспалениях, перегрузке организма калориями, нарушениях метаболизма вследствие болезней (например, диабете), злоупотреблении лекарственными средствами. Все эти воздействия могут приводить к качественно иному уровню активации р53, что приводит к апоптозу наиболее поврежденных клеток. Апоптоз сопровождается массивным выбросом кислородных радикалов, которые действуют не только на апоптозные клетки, но и оказывают действие на все микроокружение. Это создает условия для окисления ДНК, возникновения мутаций, изменения внеклеточного матрикса, с последующим накоплением поврежденных белков, развитием тканевых
патологий, гибелью клеток паренхимы органов, развитие фиброза и.т.п.

Хронические воспаления вызывают перманентный окислительный стресс в пораженных тканях, способствуя ускоренной эрозии теломер и локальной выработки ресурса регенерации ткани. Это может приводить к «локальным прогериям», то есть к локальному старению тканей, что лежит, например, в основе ряда нейродегенеративных заболеваний, а также способствует развитию легочной эмфиземы , патологии почек и т.д. В патогенезе всех этих состояний самую активную роль играет р53. Таким образом, функция р53 не только обеспечивает пресечение «неправильного поведения» клеток, но и решает судьбу людей в случае их неразумного обращения со своим здоровьем. Знание механизмов действия р53 еще раз убеждает в неоспоримом преимуществе профилактического подхода к борьбе с болезнями. В основе здоровья и долголетия лежит умеренность, и тогда р53 действительно становится нашим «Ангелом Хранителем».

Заключение

Было установлено, что белковой молекуле р53 свойственны несколько независимых по природе активностей. Несмотря на разнообразие активностей белка р53, каждая из них вносит вклад в обеспечение единой макрофункции – поддержания генетической идентичности клеток многоклеточного организма . Функция белка р53 обуславливает альтруистическое поведение клеток, при котором поврежденные и неполноценные клетки самостоятельно принимают решение о своей гибели. Через многочисленные связи на р53 сходятся сигналы об
отклонениях от оптимума процессов, а также о наличии структурных
повреждений, что, в зависимости от степени отклонения, приводит
либо к ускорению процессов репарации и защиты, либо к остановке
клеточных делений или апоптозу. Утрата функции гена р53 наблюдается практически в каждом случае злокачественных заболеваний, а его недостаточность неминуемо приводит к развитию опухолей . Понимание функции белка р53 позволяет разрабатывать не только новые подходы к лечению онкологических заболеваний, но и определять стратегию профилактики множества болезней, включая меры по замедлению процессов старения .

Названия белка

• Клеточный опухолевый антиген p53
• Опухолевый супрессор p53
• Фосфопротеин p53
• Антиген NY-CO-13

Ген белка p53

Локализация гена в геноме других организмов:

• Мышь - хромосома 11
• Крыса - хромосома 10
• Собака - хромосома 5
• Свинья - хромосома 12

Структура

Человеческий белок p53 состоит из 393 аминокислотных остатков и имеет 5 доменов :

• N-концевой домен, активирующий транскрипцию (англ. transcription-activation domain ; TAD), аминокислоты 1-42
• Богатый пролином домен, важный для апоптотической активности p53, аминокислоты 80-94
• ДНК-связывающий домен («цинковый палец»), остатки 100-300
• Домен, отвечающий за образование полимера белка (олигомеризацию), остатки 307-355. Тетрамеризация очень важна для активности p53 in vivo
• C-концевой домен, задействованный в отсоединении ДНК-связывающего домена от ДНК , аминокислоты 356-393.

Белок р53 активируется при повреждениях генетического аппарата, а также при стимулах, которые могут привести к подобным повреждениям, или являются сигналом о неблагоприятном состоянии клетки (стрессовом состоянии). Функция белка р53 состоит в удалении из пула реплицирующихся клеток тех клеток, которые являются потенциально онкогенными (отсюда образное название белка р53 - англ. guardian of the genome - хранитель генома). Данное представление подтверждается тем фактом, что потеря функции белка р53 может быть установлена в ~50 % случаев злокачественных опухолей человека. В регуляции активности белка р53 ведущая роль принадлежит посттрансляционным модификациям белка и его взаимодействиям с другими белками.

Активация белка р53

Активация белка р53 происходит в ответ на многочисленные стрессовые стимулы:

1. непосредственные повреждения ДНК (классический стимул);
2. повреждения аппарата сегрегации генетического материала (например, митотического веретена);
3. уменьшение концентрации свободных рибонуклеотидов ;
4. тепловой шок;
5. высокая концентрация NO (монооксида азота);

В быстро делящихся (пролиферирующих) клетках было обнаружено увеличение концентрации белка р53 по сравнению с делящимися медленно. Значение увеличения концентрации р53 в данном случае в том, что клетки, которые быстро реплицируют ДНК, более подвержены возникновению повреждений генетического аппарата, чем, например, неделящиеся клетки в фазе G 0 . Следовательно, увеличение концентрации р53 - это подготовка клетки для быстрой реакции на возможное возникновение повреждений ДНК. Очевидно, что для остановки клеточного цикла в условиях стимуляции пролиферации внеклеточными ростовыми факторами) требуется более высокая концентрация р53, чем в условия фазы G 0 . Вследствие строгого посттрансляционного контроля активации белка р53, высокая концентрация белка р53 сама по себе не ведёт к его активации.

Концентрация белка р53 увеличивается в результате снятия ингибирования трансляции его мРНК . Подавление трансляции происходит в результате связывания регуляторных белков с последовательностями нуклеотидов в 3"-нетранслируемой области мРНК. Модификация белка р53 приводит к его активации. Латентный (неактивный) белок р53 локализуется в цитоплазме (по крайней мере на некоторых стадиях клеточного цикла); активный белок р53 локализуется в ядре клетки . При отсутствии стрессового стимула белок р53 имеет короткий период полураспада (5-20 мин в зависимости в клеточного типа). Активация белка сопряжена с увеличением его стабильности. В регуляции стабильности (и активности) белка р53 главная роль принадлежит белку Mdm2.

Роль Mdm2 в регуляции функций p53

При нормальных условиях в клетке экспрессируются и белок р53, и белок Mdm2. Функция белка Mdm2 первоначально была установлена у мышей , отсюда название Mdm2 (англ. mouse double minute chromosome amplified oncogene - онкоген, который был амплифицирован на хромосоме типа «double minute»). Гомологичный ген человека HDM2 также является онкогеном.

N-концевой домен белка Mdm2 связывается с N-концевым трансактивирующим доменом белка р53. Таким образом, белок Mdm2 препятствует активирующему действию белка р53. Кроме того, комплекс Mdm2:р53 является ингибитором транскрипции (вероятно, вследствие сохранения способности белка р53 к присоединению к ДНК).

Белок Mdm2 является ферментом группы E3 системы убиквитин -зависимого протеолиза, причём Mdm2 специфичен в отношении белка р53. Это означает, что белок Mdm2 катализирует перенос активированного убиквитина с фермента группы Е2 на белок р53. Таким образом, белок Mdm2 является Е3-лигазой . Маркированный убиквитином белок р53 является субстратом для 26S-протеасомы, которая осуществляет протеолиз молекул белка р53. В нестрессовых условиях постоянно образуется комплекс Mdm2:р53 и осуществляется протеолиз р53. Этим объясняется низкая концентрация р53 в клетке в отсутствие стресса. Центральная роль белка Mdm2 в деградации белка р53 подтверждается и тем фактом, что добавление к клеткам моноклональных антител к комплексу Mdm2:p53 приводит к значительному увеличению концентрации белка р53. Из приведённых рассуждений также понятно, что повышенная экспрессия белка Mdm2 является онкогенным фактором, а сам белок следует отнести к протоонкогенам. Кроме 26S-протеасомы протеолиз белка р53 может осуществляться цистеиновыми протеазами семейства С2, которые также известны как кальпаины.

Активированный белок р53 стимулирует экспрессию гена mdm2. Таким образом, для регуляции активности белка р53 существует механизм отрицательной обратной связи . Ген mdm2 является поздним геном среди тех, экспрессию которых стимулирует белок р53. Относительная трансактивирующая активность белка р53 в отношении mdm2 и остальных генов-мишеней р53 задаёт тот временной промежуток, в течение которого р53 может выполнять свои функции.

Функция белка Mdm2 в маркировании белка р53 для деградации, по-видимому, не является уникальной, так как связывание киназы JNK с белком р53 приводит к убиквитилированию и последующей деградации р53.

Гипотетические модели молекулярных механизмов активации белка p53

Предложено несколько моделей молекулярных механизмов активации белка р53 . Данные модели сходны в том, что они учитывают центральную роль белка Mdm2 в регуляции состояния белка р53. Только первая из предлагаемых моделей получила наиболее полное подтверждение, тогда как остальные подтверждены только частично.

Подробно охарактеризована группа белков, которая включает киназы, родственные киназе PI(3)K (англ. phospho-inositide 3-kinase ; фосфоинозит 3-киназа). Наиболее известным белком данной группы является белок АТМ (англ. a taxia t elangiectasia m utated - белок, мутированный при комплексном заболевании, которое включает симптомы атаксии и телеангиоэктезии). Белок АТМ и родственные ему белки группы PI(3)K используют один домен для специфического связывания с двуцепочечным разрывом ДНК; при этом изменяется конформация всего белка, в том числе и второго домена, который обладает киназной активностью; связывание белка АТМ с двуцепочечным разрывом ДНК приводит к активации киназной активности белка. Киназа АТМ фосфорилирует белок р53 по остатку Ser15; киназа DNA-PK (англ. DNA-dependent protein kinase ; протеинкиназа , активность которой зависит от связывания с ДНК), другой белок рассматриваемой группы, фосфорилирует белок р53 по остаткам Ser15 и Ser37. Данные остатки серина (Ser), а также предполагаемые сайты фосфорилирования Thr18 (треонин) и Ser20 располагаются в той части белка р53, которая взаимодействует с белком Mdm2. Предполагается, что в фосфорилированной форме белок р53 не взаимодействует с белком Mdm2, что увеличивает период полураспада белка р53 и, возможно, приводит к его активации. Также было показано, что для нормально функционирующей клетки одного двуцепочечного разрыва ДНК достаточно для активации белка р53 и остановки клеточного цикла.

Вторая гипотеза предполагает, что фосфорилируются остатки белка Mdm2, которые расположены в части белка, ответственной за связывание с белком р53. Результатом является диссоциация комплекса Mdm2:р53. Такой гипотетический сайт фосфорилирования был предложен на белке Mdm2 ; при этом предполагается роль киназы DNA-PK в фосфорилировании. Данная модель не исключает предыдущую.

Третья гипотеза предполагает, что фосфорилируется Mdm2, и это приводит к ингибированию Е3-лигазной активности белка. Комплекс Mdm2:p53 не диссоциирует, но одновременно белок р53 не маркируется для деградации.

Помимо рассмотренных посттрансляционных модификаций р53 подвергается ацетилированию и гликозилированию , что приводит к увеличению аффинности белка р53 к сайтам связывания в ДНК.

Роль p19ARF в увеличении концентрации р53

Белок р53 активируется в ответ на повышенную экспрессию протоонкогенов Ras , Myc, β-катенина и аденовирусного онкогена Е1А. Это достоверно установленное биохимическое событие получило объяснение только после установления роли белка p19ARF (англ. p19 product of alternative reading frame of INK4a gene ; белковый продукт гена INK4a, который считывается с альтернативной рамки считывания и имеет массу 19 кДа). Повышенная экспрессия онкогенов приводит к значительному усилению экспрессии белка p19ARF, что по крайней мере отчасти, обусловлено увеличением концентрации транскрипционного фактора E2F. Белок p19ARF синтезируется в результате считывания альтернативной рамки гена INK4a. Ген INK4a - это ген-супрессор опухоли, который помимо p19ARF кодирует белок р16INK4a (англ. p16 inhibitor of cyclin-dependent kinases Cdk4.6 ; ингибитор циклин -зависимых киназ Cdk4.6, который имеет массу 16 кДа). Белок p19ARF связывается с Mdm2 и в меньшей степени с р53. Связывание с Mdm2 приводит к ингибированию Е3-лигазной активности Mdm2. Следовательно, увеличение концентрации белка р19ARF приводит к уменьшению скорости деградации р53 и ведёт к увеличению концентрации р53 и далее к активации белка р53.

Действие белка p53

Активированный белок р53 является специфическим транскрипционным фактором. Гены, транскрипцию которых стимулирует белок р53, кодируют белки-компоненты апоптотической программы (проапоптотические компоненты) и белки, которые регулируют клеточный цикл.

Активированный белок р53 супрессирует транскрипцию ряда генов. Этот супрессирующий эффект не связан с супрессорной функцией комплекса Mdm2:p53, так как данный комплекс супрессирует транскрипцию тех генов, которые активируются белком р53 (не связанным с белком Mdm2). В то же время супрессорный эффект белка р53 касается другого набора генов. Репрессия транскрипции по крайней мере частично объясняется тем, что белок р53 формирует комплексы с неспецифическими транскрипционными факторами, среди них белок TBP (англ. TATA-box binding protein ; белок, который связывается с последовательностью TATA), белок CBF (англ. CCAAT binding factor ; белок, который связывается с последовательностью CCAAT) и белок SP-1.

Различия между нормальной и патологической активацией протоонкогенов, воздействующих на p53

При нормальном увеличении активности протоонкогенов (например, в результате передачи пролиферативного сигнала от рецепторов цитоплазматической мембраны) активация протоонкогенов носит временный характер и значимого увеличения концентрации p19ARF не происходит.

Результатом передачи пролиферативного сигнала является одновременно активация протоонкогенов и инактивация р53. Так, для цитокинов bFGF (англ. basic fibroblast growth factor ; основный фактор роста

Ген p53: страж генома

Ген-супрессор опухолей p53 является одним из наиболее часто мутируемых генов в опухолях человека. p53 препятствует опухолевой трансформации тремя связанными друг с другом механизмами: активация временной остановки клеточного цикла (покой), индукция постоянной остановки клеточного цикла (старение), запуск программированной клеточной гибели (апоптоз). В общем, p53можно рассматривать как контролер клеточного стресса, который направляет клетки, подвергшиеся стрессу, по одному из трех путей. Различные воздействия могут запустить сигнальные пути p53, включая аноксию, неадекватную экспрессию онкогенов (например, MYC или RAS) или нарушение целостности ДНК. Управляя реакцией клетки на повреждение ДНК, p53играет центральную роль в поддержании целостности генома, как мы увидим в дальнейшем.

В здоровых клетках, не подвергшихся воздействию повреждающих факторов, p53 имеет короткий период полураспада (20 минут) вследствие его связи с MDM2, белком который метит его для последующего разрушения. В условиях стресса, например при повреждении ДНК, p53 подвергается посттранскрипционной модификации, в результате чего он высвобождается из связи с MDM2 и его период полураспада увеличивается. Не связанный с MDM2 p53 также приобретает активность как транскрипционный фактор. Обнаружены десятки генов, чья транскрипция активируется p53. Их можно объединить в две большие категории: те, которые вызывают остановку клеточного цикла и те, которые запускают апоптоз. Если повреждение ДНК может быть восстановлено во время остановки цикла, клетка возвращается в нормальное состояние; если репарация оказывается неудачной, p53 запускает апоптоз или процесс клеточного старения. Эти действия будут рассмотрены позже.

Механизмы посредством которых p53 определяет повреждение ДНК, а также адекватность ее репарации, не совсем ясны. Ключевыми инициаторами сигнального пути, связанного с повреждением ДНК являются две родственные протеинкиназы: мутированная при атаксии-телеангиоэктазии (ataxia-teleangiectasia mutated, ATM) и связанная с мутированной при атаксии-телеангиэктазии (ataxia-teleangiectasia mutated related, ATR). Как видно из названия, ген ATM был первоначально идентифицирован как герминоклеточная мутация у пациентов с атаксией-телеангиэктазией. Пациенты с этим заболеванием, которое характеризуется неспособностью репарировать некоторые виды повреждений ДНК, чаще других страдают различными злокачественными новообразованиями. ATM и ATR определяют различные типы повреждения ДНК, однако активируют похожие сигнальные пути. Будучи активированными, ATM и ATR фосфорилируют различные белки, включая p53 и белки репарации ДНК. Фосфорилирование этих двух мишеней ведет к остановке клеточного цикла и стимуляции репарации ДНК, соответственно.

Остановку клеточного цикла, опосредованную p53, можно считать фундаментальной ответной реакцией на повреждение ДНК (рис. 6-22). Это происходит в конце фазы G 1 и вызывается, главным образом, посредством p53 -зависимой транскрипции CDKI CDKN1A (p21) . Ген CDKN1A , как было описано выше, ингибирует комплексы циклин-CDK и препятствует фосфорилированию RB, что необходимо для входа клеток в G 1 фазу. Такая остановка в клеточном цикле весьма удобна, поскольку дает время для проведения репарации ДНК. p53 также помогает этому процессу, индуцируя синтез некоторых белков, таких как GADD45 (growth arrest and DNA damage, приостановка роста и повреждение ДНК), которые помогают в репарации ДНК. Также p53 может стимулировать пути репарации ДНК нетранскрипционными механизмами. Если повреждение ДНК успешно восстановлено, p53 увеличивает транскрипцию MDM2, что ведет к разрушению p53 и снятию блокировки клеточного цикла. Если повреждение не может быть восстановлено, клетка под действием p53 подвергается физиологическому старению или апоптозу.

p53-индуцированное старение – это перманентная остановка клеточного цикла , характеризующаяся специфическими изменениями в клеточной морфологии, экспрессии генов, которые отличают такую клетку от покоящихся клеток при обратимой приостановке клеточного цикла. Старение требует активации p53 и/или RB, а также экспрессии других медиаторов, таких как CDKIs. Такая остановка клеточного цикла обычно необратима, хотя она может требовать продолжающейся экспрессии p53. Механизмы старения неясны, однако что они затрагивают глобальные изменения хроматина, которые коренным образом и навсегда изменяют экспрессию генов.

p53-индуцированный апоптоз клеток с необратимым повреждением ДНК – последний защитный механизм против опухолевой трансформации. Он опосредован несколькими проапоптотическими генами, такими как BAX и PUMA (будет рассмотрено ниже).

Суммируя вышесказанное, p53 определяет повреждение ДНК и способствует ее репарации, вызывая приостановку в фазе G 1 и индуцируя гены репарации ДНК. Клетка с необратимым повреждением ДНК, под действием p53 подвергается либо физиологическому старению либо апоптозу (рис. 6-22). В свете своих свойств, p53 был удачно назван «стражем генома». При гомозиготной потере p53 повреждение ДНК остается неотрепарированным, в делящихся клетках накапливаются мутации, что направляет клетку на путь, ведущий к опухолевой трансформации.

Подтверждением важности p53 в контроле над канцерогенезом является то, что в более чем 70% опухолей человека имеется дефект этого гена, оставшиеся злокачественные опухоли имеют дефекты генов, имеющих отношение к функции p53 . Гомозиготная потеря p53 обнаружена практически во всех злокачественных опухолях, включая раки легкого, толстой кишки и молочной железы – три основные причины смертности от рака. В большинстве случаев, инактивирующие мутации обоих аллелей p53 появляются в соматических клетках. Гораздо реже, некоторые индивидуумы наследуют мутантные аллели p53 . Такое заболевание называется синдром Ли-Фраумени. Как и с геном RB , наследование одного мутантного аллеля делает его носителей предрасположенными к развитию злокачественных опухолей, поскольку требуется только одна мутация для того, чтобы инактивировать вторую, нормальную аллель. Пациенты с синдромом Ли-Фраумени имеют повышенный в 25 раз риск развития злокачественных опухолей к 50 годам, по сравнению с общей популяцией. В отличие от пациентов, которые наследуют мутантный аллель RB , спектр опухолей, развивающихся у пациентов с синдромом Ли-Фраумени более широкий; наиболее часто развиваются саркомы, рак молочной железы, лейкемия, опухоли мозга и карциномы коры надпочечника. По сравнению со спорадическими опухолями, опухоли у пациентов с этим синдромом развиваются в более молодом возрасте и могут быть первично-множественными.