Anemia aplástica adquirida, sintomas e tratamento. Hemoglobinúria paroxística noturna (doença de Marchiafava-Miceli) O que fazer se os testes para HPN forem positivos

Detentores da patente RU 2574968:

A invenção refere-se à medicina, nomeadamente ao diagnóstico laboratorial, e pode ser utilizada para o diagnóstico da hemoglobinúria paroxística noturna. Para isso, a amostra de sangue em estudo é corada com anticorpos monoclonais CD235a (FITC)/CD59(PE)/CD71 (APC). A presença de um clone de HPN entre eritrócitos e reticulócitos é avaliada pela ausência da proteína protetora CD59 na membrana dos reticulócitos isolados pela porta CD235a - marcador pan-eritrocitário e CD71 - receptor de transferrina. Para avaliar o clone HPN entre reticulócitos na porta CD71+ pelo menos 20.000 eventos são coletados dependendo da porta CD71+ é construído um gráfico FSC(log) vs SSC(log) no qual os reticulócitos são isolados usando a porta CD71str adicional limpando assim a população de reticulócitos de detritos e dupletos usando o método de gating sequencial. Se houver 100% de reticulócitos positivos para CD59, avalia-se a ausência de um clone HPN e diagnostica-se a ausência de hemoglobinúria paroxística noturna. Se forem detectados reticulócitos CD59 negativos em um paciente com sintomas clínicos e o valor dos indicadores obtidos for superior a 1%, é dada uma conclusão diagnóstica sobre a presença de um clone de HPN e para confirmar o diagnóstico de hemoglobinúria paroxística noturna, um estudo adicional é recomendado de acordo com o protocolo padronizado internacional. Se forem detectados reticulócitos negativos para CD59 e o valor dos indicadores obtidos for de 0,1-1%, a presença de um clone menor de HPN é julgada e recomenda-se redeterminar o clone de HPN após 6 meses para verificar se há um aumento em seu valor e o desenvolvimento de hemoglobinúria paroxística noturna, e se esse tamanho for confirmado, o clone é diagnosticado com uma forma subclínica de hemoglobinúria paroxística noturna sem sinais clínicos. O uso de controle multiparâmetro de células CD71+ torna possível excluir da análise detritos, dupletos e anticorpos monoclonais ligados de forma inespecífica. 1 doente.

A invenção refere-se ao campo da medicina, nomeadamente métodos de diagnóstico clínico e laboratorial, e pode ser utilizada para diagnóstico de triagem de hemoglobinúria paroxística noturna (HPN).

A hemoglobinúria paroxística noturna é uma doença rara.

A HPN ocorre devido a uma mutação no gene PIG-A. Como resultado, a síntese da âncora glicosilfosfatidilinositol (GPI), que fixa numerosas moléculas na membrana das células sanguíneas (incluindo CD24 nos granulócitos, CD14 nos monócitos, CD59 nos eritrócitos e seus precursores), que protegem as células sanguíneas dos efeitos da o sistema complemento é interrompido.

A membrana dos glóbulos vermelhos está mais exposta ao complexo de ataque à membrana e, na ausência da proteína protetora CD59, os glóbulos vermelhos sofrem hemólise.

A HPN é caracterizada por hemólise intravascular, anemia, hemoglobinúria, complicações trombóticas, disfagia, letargia, disfunção erétil, insuficiência renal crônica e hipertensão pulmonar.

Além disso, o clone HPN pode ocorrer na anemia aplástica, na anemia hemolítica autoimune e na síndrome mielodisplásica. A mediana de idade para ocorrência da HPN é de 30 a 35 anos. A incidência de hemoglobinúria paroxística noturna é de 1 a 10:1 milhão de pessoas. A taxa de mortalidade não tratada para hemoglobinúria paroxística noturna é de cerca de 35% dentro de 5 anos após o início da doença.

Atualmente, surgiram tecnologias celulares que permitiram desenvolver métodos modernos de tratamento desta doença.

Nesse sentido, surgiu a necessidade de criar métodos diagnósticos precisos, pois a eficácia e adequação do tratamento dependem da informatividade, objetividade e evidência das medidas diagnósticas, e da completude das informações recebidas, o que permite avaliar a presença de um clone da HPN e esclarecer o diagnóstico.

Existe um método conhecido para detectar HPN usando o método Hem para o diagnóstico de hemoglobinúria paroxística noturna (Abdulkadyrov K.M., Clinical Hematology, Reference - St. Petersburg: Peter, 2006, p. 82), baseado na estimulação da inativação do sistema complemento como resultado da acidificação da amostra de sangue e aumento da sensibilidade a ela eritrócitos de pacientes com hemoglobinúria paroxística noturna. O resultado do teste Hem é avaliado visualmente.

O método consiste em adicionar ao soro sanguíneo do doador uma solução normal de HCl 0,2, que é comparável ao soro do paciente segundo o sistema de antígeno ABO, alterando seu pH sérico para 6,4 e causando assim a ativação do complemento (relação soro/ácido 9: 1) . Em seguida, dez volumes de soro de leite acidificado são misturados com um volume de suspensão a 50% de eritrócitos lavados. Em seguida, é realizada uma avaliação visual da suspensão resultante. Na hemoglobinúria paroxística noturna, ocorre hemólise dos glóbulos vermelhos e a suspensão torna-se avermelhada ou vermelha, enquanto os glóbulos vermelhos normais nas mesmas condições não são hemolisados.

No entanto, a técnica não tem sensibilidade suficiente para determinar clones menores de HPN: o tamanho mínimo do clone detectável é de 4,2-5%. O método de Hem não fornece informações sobre o tamanho do clone.

Tudo isso não permite estimar o clone da HPN em percentual, que, quando a doença é detectada durante a triagem, é o ponto de partida para posterior monitoramento e tratamento adequado.

Além disso, a técnica é muito trabalhosa e não atende aos requisitos diagnósticos modernos.

Também existe um método conhecido para diagnosticar hemoglobinúria paroxística noturna usando um teste de sacarose (“Problems of hematology and blood transfusion”, 1972, agosto, 17(8)55-7, “Avaliação do teste de sacarose para o diagnóstico de hemoglobinúria paroxística noturna ”, Idelson L.I., Benisovich V.I., Savina L.S., Radzhivilovskaya E.G.).

O método baseia-se no aumento da sensibilidade dos eritrócitos de um paciente com hemoglobinúria paroxística noturna às proteínas do sistema complemento, neste caso devido à adição de sacarose.

Soro de doador fresco idêntico ao grupo sanguíneo do paciente é adicionado aos glóbulos vermelhos do paciente. Os glóbulos vermelhos são lavados três vezes em solução salina (NaCl 0,145 M), 100 μl de sangue citratado ou desfibrinado são adicionados a 900 ml de solução de sacarose e incubados por 30 minutos a 37°C ou 23°C. Os tubos são então centrifugados e o sobrenadante é avaliado quanto à hemólise visível. Caso ocorra hemólise, seu grau, expresso em porcentagem, é calculado a partir da concentração de hemoglobina sobrenadante, que é determinada pelo método da cianometemoglobina.

Amostras de sangue total são misturadas 9:1 com citrato de sódio a 3,2% ou solução de oxalato 0,1 M, e o sangue total é desfibrinado pela adição de uma esfera de vidro de 4 mm a 2 ml de sangue. Alíquotas de sangue total e plasma livre de plaquetas são misturadas em proporções variadas. Uma solução isotônica de sacarose é preparada dissolvendo 0,27 mol de um reagente especial de sacarose em 91 ml de NaH 2 PO 4 50 mM e 9 ml de NaHPO 4. Se necessário, o pH é ajustado para 6,1 com pequenas concentrações de NaOH. 1000 ml de água são despejados no volume final.

Os tubos são centrifugados e o sobrenadante é avaliado quanto à hemólise visível. A porcentagem de hemólise é um valor calculado, calculado a partir da concentração de hemoglobina sobrenadante, determinada pelo método da cianometemoglobina. Também são preparadas outras duas alíquotas - hemólise 100% e hemólise “zero” (sem hemácias) para avaliação da amostra.

A desvantagem desse método é a falta de sensibilidade e especificidade para o diagnóstico da doença: o tamanho mínimo detectável do clone - 4,2-5% não dá uma ideia precisa do tamanho do clone, embora possa estar presente no paciente sangue em valores mais baixos - menos de 4,2%. As desvantagens deste método também incluem a intensidade do trabalho.

Existe também um método conhecido para diagnosticar o clone HPN (Rosse WF. Variations in the red cells in paroxysmal nocturnal haemoglobinuria. Br J Haematol 1973; 24:327-42. 12), incluindo medição e análise do grau de hemólise em diferentes concentrações de complemento. Este ensaio mostra que as células HPN são lisadas em concentrações mais baixas do que as células normais.

Este teste identifica populações de células com sensibilidade intermediária às proteínas do complemento (tipo II) entre glóbulos vermelhos normais (tipo I) e glóbulos vermelhos patológicos na hemoglobinúria paroxística noturna (tipo III). No entanto, o método é trabalhoso e difícil de padronizar. Ao usar o teste, pequenas populações de células anormais podem não ser detectadas.

Existe um método conhecido para isolar reticulócitos por CD71 para determinar o clone da HPN por citometria de fluxo entre reticulócitos e granulócitos (Tsagarakis NJ, Paterakis G. Asimple flow cytometric assay for rotina paroxysmal nocturnal hemoglobinuria testing based on immature reticulocytes and granulocytes. - ClinicalCytometry, 07.2012 . - C. 259-263) (http://onlinelibrary.wiley.coni/doi/10.1002/cyto.b.21030/full).

O sangue total do paciente é examinado e diluído em solução salina tamponada com fosfato 1:100. 50 μl de sangue diluído são adicionados a dois tubos e, em seguida, é realizada a coloração: no primeiro tubo, 10 μl de anticorpos monoclonais (mAbs) para CD71 e 20 μl de mAbs para CD59; 10 µl de IgGl de controle de isotipo são adicionados ao segundo tubo. Os resultados são avaliados usando histogramas de parâmetro único.

Além disso, o método também analisa granulócitos utilizando combinações de mAbs: 1) CD59-FITC /CD24-PE /CD45-PE-Cy5/; 2) CD66b-FITC/CD16-PE/CD45-PE-Cy5.

De acordo com este método, a sensibilidade de determinação do clone HPN entre granulócitos é de 1%, a sensibilidade de determinação do clone HPN entre reticulócitos é de 5%. No entanto, o método proposto foi testado em um pequeno número de pacientes com hemoglobinúria paroxística noturna (n=8) e com um clone de HPN inferior a 1% (quando avaliado em granulócitos e, consequentemente, inferior a 5% quando determinado em reticulócitos). ) (n=7). Além disso, a sensibilidade da determinação do clone em reticulócitos (5%) não permite a utilização da técnica para avaliação simultânea do clone entre granulócitos e reticulócitos. Ao mesmo tempo, entre as amostras de sangue de pacientes com suspeita de HPN não houve nenhuma com tamanho de clone de 1 a 24%, o que não dá um quadro completo da correlação de valores nessa faixa. Com esta abordagem, o gating de reticulócitos é difícil devido à ausência de um marcador pan-eritrocitário (CD235a) no painel, que é especialmente necessário para isolar uma população pura e eliminar detritos e dupletos. Além disso, para avaliar objetivamente um clone de HPN, devem ser avaliadas dezenas de milhares de células. Um teste utilizando o método proposto requer uma grande quantidade de anticorpos. O número total de eventos bloqueados (CD71) coletados (2.000 eventos) pode não ser suficiente para identificar um clone.

Assim, o método conhecido foi testado num pequeno número de pacientes com hemoglobinúria paroxística nocturna e células clones de HPN que se ligam inespecificamente a mAbs CD71 são susceptíveis de distorcer os resultados da análise; Além disso, para esta análise são utilizados 6 tipos de anticorpos monoclonais, sendo 2 deles utilizados duas vezes, o que se reflete no alto custo do painel de mAb utilizado. O método foi testado em 8 pacientes com HPN, 7 deles apresentavam valor de clone abaixo do limite de sensibilidade (1% para granulócitos, 5% para reticulócitos). Este método não resolve o problema de identificação confiável de clones menores de HPN e não prova a alta sensibilidade do método.

Como análogo mais próximo, é conhecido um método de diagnóstico de hemoglobinúria paroxística noturna por citometria de fluxo, proposto pela Associação Internacional de Citometria Clínica (ICCS). (Michael J. Borowitz, Fiona E. Craig, Joseph A. DiGiuseppe, Andrea J. Illingworth, Wendell Rosse, D. Robert Sutherland, Carl T. Wittwer, Stephen J. Richards. Diretrizes para o diagnóstico e monitoramento da hemoglobinúria paroxística noturna e relacionados por distúrbios da citometria de fluxo, online: 28 APR 2010.DOI:10.1002/cyto.b.20525).

O método envolve o estudo da presença de proteínas ligadas ao GPI em granulócitos, monócitos e eritrócitos. O estudo consiste em duas etapas: preparação da amostra e posterior análise em citômetro de fluxo.

Para analisar os glóbulos vermelhos, o sangue total é diluído com solução salina tamponada com fosfato na proporção de 1:100, 10 μl de sangue total são adicionados a 990 μl de solução salina tamponada com fosfato; Em seguida, 40 μl da suspensão celular resultante são adicionados ao tubo rotulado. Para corar eritrócitos, anticorpos monoclonais conjugados com fluorocromos CD59 marcados com CD235FITC e marcados com PE são adicionados à suspensão celular, respectivamente. Após incubação com anticorpos monoclonais durante 30 minutos no escuro, as amostras são lavadas para remover os anticorpos monoclonais não ligados. Para analisar os eritrócitos, a lavagem é realizada duas vezes centrifugando a amostra em 4 ml de solução salina tamponada com fosfato a 1500 rpm por 5 minutos, em seguida, o sobrenadante é retirado, as células são ressuspensas e 500 μl de solução salina tamponada com fosfato são adicionados para posterior análise.

Para coletar e analisar glóbulos vermelhos em um citômetro de fluxo, os seguintes gráficos são gerados usando o software do dispositivo:

Gráfico-FS(log) vs (contra) SS(log), no qual a população de eritrócitos é isolada (é criada uma porta de hemácias) e detritos, plaquetas e agregados de eritrócitos são filtrados;

O gráfico CD235a(log) vs FS(log) reflete eventos da porta RBC para destacar mais claramente a população de eritrócitos, a população de eritrócitos positiva para o marcador CD235a e cria uma nova porta (CD235a+)

CD59(log) vs CD235a, (o histograma mostra eventos controlados por CD235a+). O histograma mostra o nível de expressão de CD59 nos glóbulos vermelhos. Células sem deficiência de CD59 - tipo I são eritrócitos normais, células com deficiência parcial de expressão de CD59 são clone de HPN tipo II, células que não expressam CD59, ou seja, eritrócitos com deficiência completa de CD59 são clone de HPN tipo III.

De acordo com o método, são coletados pelo menos 50.000 eventos citométricos.

Para se preparar para a análise de granulócitos e monócitos, adicione 100 μl de sangue periférico a dois tubos rotulados. Em seguida, para corar com anticorpos monoclonais marcados, uma combinação diferente de anticorpos monoclonais marcados é adicionada a cada tubo:

uma combinação de anticorpos monoclonais marcados para determinar o clone HPN entre granulócitos FLAER(AlexaFluor700)/CD15(PE)/CD24(PerCP)/CD45(PE-Cy7) (marcadores de controle: CD45 e CD15, marcadores relacionados a GPI FLAER e CD24) ;

uma combinação de anticorpos monoclonais marcados para determinar o clone HPN entre monócitos FLAER(AlexaFluor700)/CD14PE/CD64PerCP/CD45PE-Cy7, onde foram marcados marcadores: CD45 e CD64, marcadores relacionados ao GPI FLAER e CD14;

As amostras coradas são incubadas durante 30 minutos à temperatura ambiente no escuro, após o que 1 ml de solução de lise é adicionado à amostra para remover os glóbulos vermelhos. Após a incubação com a solução de lise, as amostras são centrifugadas durante 5 minutos a 1500 rpm, após a centrifugação o sobrenadante é drenado e os leucócitos do fundo do tubo são ressuspensos. Em seguida, as amostras são lavadas da solução de lise adicionando 2 ml de solução salina tamponada com fosfato à amostra e subsequente centrifugação durante 5 minutos a 1500 rpm. Após a centrifugação, o sobrenadante é descartado, as células são ressuspensas e 500 μl de solução salina tamponada com fosfato são adicionados para análise posterior.

Para analisar e coletar granulócitos e monócitos em um citômetro de fluxo, os seguintes gráficos são gerados usando o software do dispositivo:

No gráfico CD45(log) vs SS, as áreas de linfócitos CD45+LY (células da área de alta expressão de CD45, baixos valores de SS), monócitos CD45+MON (células da área de expressão média de CD45, maiores valores de SS) e granulócitos CD45+GRAN (células de áreas de baixa expressão de CD45, altos valores de SS).

Para analisar o clone HPN entre granulócitos, um gráfico de CD 15 (log) vs SS é traçado dependendo da porta (CD45+GRAN). Usando a porta CD15+, uma população de granulócitos é isolada sem detritos e células que não ligaram anticorpos monoclonais ao CD15;

Histograma FLAER(log) vs CD24(log) (construído dependendo da porta CD15+. Este gráfico traça a porta PNH GRAN, que captura a zona negativa para a expressão de CD24 e FLAER. A ausência desses marcadores nos granulócitos indica que as células pertencem ao clone HPN.

Para avaliar o clone HPN entre monócitos, um gráfico de -CD64(log) vs SS é traçado dependendo da porta CD45 MON. Neste gráfico, os eventos positivos para C064 estão limitados à porta CD64+MON. Dependendo da porta CD64+MON, um gráfico -FLAER(log) vs CD14(log) é traçado (dependendo da população selecionada de monócitos CD64+ - porta). Este gráfico representa a porta PNH MON, que captura a zona negativa para a expressão CD14 e FLAER. A ausência destes marcadores nos monócitos indica que as células pertencem ao clone HPN.

O valor do clone HPN é a porcentagem de células (granulócitos, monócitos, eritrócitos) entre as quais há ausência de proteínas âncoras ligadas ao GPI.

O estudo do clone da HPN segundo o protocolo internacional é o “padrão ouro” no diagnóstico da HPN. No entanto, a pesquisa é cara e demorada. Demora pelo menos 2,5 a 3 horas para preparar e realizar a análise de acordo com este método.

Por ser a HPN uma doença rara, segundo diversas fontes, afeta de 1 a 10 pessoas por 1 milhão de habitantes, a maioria dos pacientes encaminhados para diagnóstico do clone HPN não será HPN positiva. Portanto, não é aconselhável realizar uma análise trabalhosa e dispendiosa de acordo com o protocolo internacional para pacientes com ausência de HPN, mas basta apenas responder à questão se um clone de HPN está presente ou não. Com o custo dos anticorpos monoclonais marcados a partir de 500 USD. para um item, um conjunto completo de anticorpos e reagentes para diagnóstico de HPN de acordo com a abordagem internacional custará a partir de 5.000 USD. Dado o curto prazo de validade de alguns dos reagentes necessários, mesmo em uma cidade com população de 1 milhão de pessoas, de 10 a 100 pacientes por ano podem ser examinados com um kit, respectivamente, o custo de um estudo pode chegar a 500 USD.

O objetivo da invenção é criar um método preciso, sensível e baseado em evidências para diagnóstico laboratorial de hemoglobinúria paroxística noturna, que seja de fácil implementação, acessível e permita a triagem de hemoglobinúria paroxística noturna com custos mínimos de material.

A essência da invenção é que em um método para diagnóstico laboratorial de hemoglobinúria paroxística noturna, incluindo coloração do sangue total do paciente com anticorpos monoclonais em solução salina tamponada com fosfato, incubação, lavagem de células sanguíneas de anticorpos monoclonais não ligados por centrifugação, ressuspensão da amostra acabada , avaliação posterior do tamanho do clone ou sua ausência no programa do citômetro de fluxo para ausência ou presença de proteínas protetoras, para corar a amostra de sangue em estudo, uma combinação de três cores de anticorpos monoclonais CD235a (FITC)/CD59(PE)/ Utiliza-se CD71 (APC), que são adicionados ao tubo de ensaio com a amostra, a presença do clone HPN entre eritrócitos e reticulócitos é avaliada pela ausência da proteína protetora CD59 na membrana dos reticulócitos isolados pela porta CD235a - um marcador pan-eritrocitário e receptor de transferrina CD71 para avaliar o clone HPN entre reticulócitos na porta CD71+, pelo menos 20.000 eventos são coletados, dependendo da porta CD71+, um gráfico é traçado FSC(log) vs SSC(log), em; quais reticulócitos são isolados usando uma porta CD71str adicional, purificando assim a população de reticulócitos de detritos e dupletos usando o método de gating sequencial, os valores indicadores obtidos são comparados com critérios normais, e na presença de 100% de reticulócitos CD59 positivos a ausência do clone HPN é avaliado e a ausência de hemoglobinúria paroxística noturna é diagnosticada. Se forem detectados reticulócitos CD59 negativos em um paciente com sintomas clínicos e o valor dos indicadores obtidos for superior a 1%, é dada uma conclusão diagnóstica sobre a presença de um clone de HPN e para confirmar o diagnóstico de hemoglobinúria paroxística noturna, um estudo adicional é recomendado de acordo com o protocolo padronizado internacional, se os reticulócitos CD59 forem negativos e o valor for os indicadores obtidos de 0,1-1% julgar a presença de um clone menor de HPN e recomendar a redeterminação do clone de HPN após 6 meses para um aumento em seu valor e o desenvolvimento de hemoglobinúria paroxística noturna, após a confirmação do tamanho deste clone, é diagnosticada uma forma subclínica de hemoglobinúria paroxística noturna sem sinais clínicos;

A utilização da invenção permite obter o seguinte resultado técnico.

O método proposto para identificação do clone HPN apresenta alta confiabilidade, precisão e sensibilidade - 0,1%, comparável ao método padronizado internacionalmente, e é baseado em evidências.

Permite determinar a presença de clones de HPN tanto de tamanho significativo em pacientes com hemoglobinúria paroxística noturna verdadeira, quanto menores - de 0,01 a 1%, em pacientes com anemia aplástica e síndrome mielodisplásica.

O método é mais simples de implementar e não requer grandes custos de material em comparação com o método padronizado internacional.

A tecnologia de determinação do clone da HPN permite utilizar uma quantidade mínima (três) de anticorpos monoclonais na triagem da HPN (CD235a, CD71, CD59).

Para testar o sangue de um paciente, é utilizado apenas um tubo, o que também simplifica e agiliza a análise.

O tempo necessário para realizar um teste é de 40 a 50 minutos. Usar menos anticorpos sem usar soluções de lise torna o ensaio aproximadamente 75% mais barato por ensaio. Ao mesmo tempo, a alta sensibilidade e a precisão do diagnóstico são mantidas.

Na maioria dos casos, o método evita custos adicionais associados à utilização de mais anticorpos, uma vez que, devido à rara ocorrência da doença, o resultado muitas vezes é negativo. A técnica é adequada para triagem de pacientes e está disponível para instituições médicas de diversos perfis, bem como para todas as categorias de cidadãos.

O resultado final da análise no método proposto é apresentado como percentual de eritrócitos e reticulócitos com defeito nas proteínas ligadas ao GPI, ou seja, um clone HPN. A técnica permite determinar o risco aumentado de trombose com base na porcentagem de clone HPN identificado.

O método proposto é preferível em comparação com alguns outros métodos bem conhecidos - teste de Hem, teste de sacarose, medindo o grau de hemólise em várias concentrações de proteínas do sistema complemento.

O resultado técnico é alcançado devido à nova tecnologia desenvolvida pelos autores para determinação do clone HPN na hemoglobinúria paroxística noturna por citometria de fluxo, cujo algoritmo prevê a determinação desse clone em reticulócitos e eritrócitos (em oposição à determinação padrão em neutrófilos, monócitos e eritrócitos). Neste caso, os autores utilizam pela primeira vez a combinação de anticorpos CD235a(FITC)/CD59 (PE)/CD71(APC). De acordo com o método proposto, no momento da análise dos dados, um procedimento adicional é utilizado para controle multiparâmetro de células CD71+ e exclusão de detritos, dupletos da análise e eliminação de anticorpos monoclonais ligados de forma inespecífica.

O ponto chave é realizar um estudo de reticulócitos, que, de acordo com a tecnologia desenvolvida pelos autores, são isolados com anticorpos anti-CD71 e examinados com uma combinação de três anticorpos monoclonais CD235a(FITC)/CD59(PE)/CD71(APC ) selecionados pelos autores. O clone HPN entre reticulócitos reflete o verdadeiro valor do clone HPN; os autores compararam os valores obtidos de clones HPN entre reticulócitos com os valores obtidos por meio de uma abordagem internacional padronizada para o diagnóstico de HPN. A correlação do volume de reticulócitos positivos para HPN com monócitos é de 0,95, com granulócitos - 0,93. A porcentagem de glóbulos vermelhos positivos para HPN de acordo com o método proposto é medida com maior sensibilidade em comparação com a abordagem padronizada internacional, porque Usando o método proposto, pelo menos 1.000.000 de glóbulos vermelhos são examinados e, de acordo com o ICCS, apenas 500.000.

Pela primeira vez, foi realizado um estudo do clone HPN em reticulócitos utilizando uma combinação de anticorpos monoclonais CD235a/CD71/CD59, o que permitiu estimar o tamanho deste clone com sensibilidade de 100%.

Como resultado, tornou-se possível rastrear a HPN utilizando três anticorpos monoclonais. O uso de uma etapa adicional de isolamento de reticulócitos e “corte” de células ligadas inespecificamente a anticorpos monoclonais (no gráfico FS vs SS, Fig.) fornece um resultado preciso, que permite confirmar o diagnóstico de HPN com base na triagem e realizar um tratamento adequado e eficaz.

O método é realizado da seguinte forma.

Para realizar o estudo, o sangue venoso do paciente é colocado em um tubo de ensaio com o anticoagulante K 2 EDTA. O tubo de ensaio é entregue ao laboratório a partir da sala de tratamento do centro de tratamento e prevenção (HCI).

Para analisar glóbulos vermelhos e reticulócitos, o sangue total é diluído em um tubo de poliestireno separado. Para diluir com solução salina tamponada com fosfato em uma proporção de 1:10, 50 μl de sangue total são adicionados a 450 μl de solução salina tamponada com fosfato e misturados completamente por 5 segundos em um vórtice, em seguida, 40 μl da suspensão celular resultante são adicionados. para um tubo rotulado.

Para corar a amostra, é utilizada uma combinação de três cores de anticorpos monoclonais - CD235a(FITC)/CD59(PE)/CD71(APC). A coloração é realizada adicionando 3 μl de anticorpos monoclonais marcados sequencialmente à amostra, após o que o tubo é agitado durante 5 segundos num vórtice. Em seguida, incube por 15 minutos no escuro em temperatura ambiente.

Em seguida, as células sanguíneas são lavadas duas vezes em 4 ml de solução salina tamponada com fosfato em modo de centrifugação durante 5 minutos a uma frequência de 1500 rpm. Após cada centrifugação, recolher cuidadosamente o sobrenadante utilizando uma pipeta para que as células permaneçam no fundo do tubo.

A amostra finalizada é ressuspensa por 5 segundos em vórtice e 750 μl de solução salina tamponada com fosfato são adicionados, após o que a amostra está pronta para análise em um citômetro de fluxo.

Em seguida, os resultados são avaliados e registrados por citometria de fluxo multicolor. A análise pode ser realizada em qualquer citômetro de fluxo equipado com detectores para pelo menos três canais fluorescentes.

As medições são realizadas num citómetro de fluxo BD FACSCanto™ II Becton-Dickinson (EUA).

A avaliação da presença ou ausência de um clone HPN em eritrócitos e reticulócitos, bem como o tamanho do clone HPN, é realizada em um citômetro de fluxo por meio de software especial.

Para avaliar o clone da HPN entre eritrócitos e reticulócitos, é construído um gráfico - FSC(log) vs SSC(log), utilizando uma restrição lógica, isola-se a área de eritrócitos, excluindo detritos e dupletos (Fig. 1a).

Uma porta CD235a + é então construída no gráfico FSC (log) vs CD235a (Fig. 1b), limitando assim as células positivas e excluindo eventos que se ligam inespecificamente ao CD235a (resíduos e células não pertencentes à população CD235a +).

Os eventos que entram na porta CD235a + são analisados ​​​​no gráfico CD71 vs FSC (log) (Fig. 1e), que destaca a população positiva para CD71.

Para avaliar objetivamente o clone HPN entre os reticulócitos na porta CD71+, são coletados pelo menos 20.000 eventos.

Dependendo da porta CD71+, um gráfico de FSC(log) vs SSC(log) é traçado (Fig. 1f), no qual os reticulócitos são isolados usando uma porta adicional CD71str e assim a população é finalmente limpa de detritos e dupletos usando o método de portas sequenciais.

A seguir, um gráfico de CD235a vs CD59 é traçado (Fig. 1g) dependendo da porta CD71str (reticulócitos selecionados). Este gráfico distingue duas regiões, Norm ° Ret e PNH ° Ret (Fig. 1g), estes são os limites dos reticulócitos normais e positivos para HPN, respectivamente. As estatísticas são mostradas em valores absolutos e % de gate (Figuras 1d e 1h).

Os protocolos de coleta de dados são estabelecidos uma vez e apenas pequenos ajustes são necessários posteriormente.

A porta CD235a+ é uma porta de parada no primeiro estágio de aquisição de dados, ou seja, ele coleta 1.000.000 de eventos. A porta CD235a + é aplicada ao gráfico CD235a vs CD59 (Fig. 1c). Se nas regiões HPN Tipo II e HPN Tipo III não houver mais de 10 eventos no total no gráfico CD235a vs CD59, a coleta de dados é interrompida e conclui-se que não há clone HPN.

Se o número total de eventos nessas regiões aumentar, o estudo continua.

O clone HPN entre os reticulócitos é a porcentagem de reticulócitos que não possuem a proteína protetora CD59.

Se houver 100% de reticulócitos positivos para CD59, avalia-se a ausência de um clone HPN e diagnostica-se a ausência de hemoglobinúria paroxística noturna.

Se forem detectados reticulócitos CD59 negativos em um paciente com sintomas clínicos e o valor dos indicadores obtidos for superior a 1%, é dada uma conclusão diagnóstica sobre a presença de um clone de HPN e para confirmar o diagnóstico de hemoglobinúria paroxística noturna, um estudo adicional é recomendado de acordo com o protocolo padronizado internacional (Michael J. Borowitz, Fiona E. Craig, Joseph A. DiGiuseppe, Andrea J. Illingworth, Wendell Rosse, D. Robert Sutherland, Carl T. Wittwer, Stephen J. Richards. Diretrizes para o diagnóstico e monitoramento da hemoglobinúria paroxística noturna e distúrbios relacionados por citometria de fluxo).

Se não forem detectados reticulócitos CD59 negativos e os valores obtidos forem de 0,1-1%, avalia-se a presença de um clone menor de HPN. Neste caso, recomenda-se redeterminar o clone da HPN após 6 meses para verificar aumento do seu valor e desenvolvimento de hemoglobinúria paroxística noturna.

Ao confirmar o tamanho deste clone por citometria de fluxo, de acordo com o protocolo internacional, uma forma subclínica de hemoglobinúria paroxística noturna sem sinais clínicos é diagnosticada ou um clone de HPN acompanhando AA e SMD é avaliado ao fazer diagnósticos apropriados de acordo com as recomendações (International PNH Interest Group (I-PIG)).

O método foi aprovado em testes clínicos no Departamento de Diagnóstico Laboratorial Clínico da Academia Médica Russa de Educação de Pós-Graduação. Foram examinados 572 pacientes encaminhados de diversas unidades de saúde com diagnóstico preliminar ou suspeita de hemoglobinúria paroxística noturna (HPN), anemia aplástica (AA), síndrome mielodisplásica (SPM), anemia hemolítica autoimune (AIHA), com idades entre 12 e 82 anos.

Todos os pacientes foram diagnosticados pelo método proposto por citometria de fluxo multicolorido, bem como pela abordagem padronizada internacional.

A ausência da proteína protetora CD59 na membrana dos reticulócitos isolados por CD235a (marcador pan-eritrocitário) e CD71 (receptor de transferrina) e adicionalmente purificados por gating sequencial de acordo com parâmetros de dispersão de luz FS/SS foi determinada uma alta correlação do volume; foi comprovado o clone de HPN medido entre reticulócitos, de acordo com o método proposto com um clone de HPN entre granulócitos e monócitos, medido de acordo com uma abordagem padronizada internacionalmente.

Foram examinadas 572 pessoas com idade entre 15 e 64 anos, sendo 248 homens e 324 mulheres. Dos 572 examinados, o clone HPN foi detectado em 175 pacientes, valores variaram de 0,1% a 99,7% (mediana 41,6%). Entre eles estão 78 homens e 97 mulheres. Todos os pacientes foram submetidos a estudos paralelos do clone HPN de acordo com a abordagem padronizada internacional e utilizando o método proposto. A correlação entre o valor do clone HPN entre reticulócitos e granulócitos foi de 0,93, entre reticulócitos e monócitos 0,95, respectivamente. A sensibilidade do método foi de 98,9%, especificidade de 99,8% e precisão geral de 99,7%.

Basicamente, na anemia aplástica e na síndrome mielodisplásica, o clone da HPN é inferior a 1%. De acordo com as recomendações, clones deste tamanho devem ser examinados ao longo do tempo em intervalos de 1 vez a cada 6 meses. Com o aumento do tamanho do clone e dos sinais clínicos correspondentes, estamos falando em fazer o diagnóstico de HPN.

Exemplo. O paciente M., 34 anos, estava sob supervisão de um hematologista. Após sofrer de infecção viral respiratória aguda, foram observados aumento de fraqueza, icterícia e urina escura.

O paciente foi internado no setor de uma unidade de saúde com queixas de fraqueza e urina escura.

Um exame de rotina foi realizado no ambulatório da unidade de saúde. Um exame objetivo revelou icterícia da pele e membranas mucosas visíveis. O paciente foi internado no serviço de hematologia com queixas de fraqueza geral, mal-estar, falta de ar, taquicardia, urina escura e diminuição da quantidade de hemoglobina e hemácias.

Um tubo de ensaio com uma amostra de sangue periférico estabilizado com K2EDTA foi enviado ao Departamento de Diagnóstico Laboratorial Clínico da Academia Médica Russa de Educação de Pós-Graduação ao centro de referência para o estudo da HPN para identificação do clone da HPN por citometria de fluxo. A análise do clone HPN entre granulócitos, monócitos e eritrócitos foi feita de acordo com o protocolo internacional, e o estudo do clone HPN foi realizado pelo método proposto em eritrócitos e reticulócitos.

Paralelamente, foi realizado um estudo do clone HPN de acordo com o protocolo internacional e de acordo com a metodologia proposta (repetição da frase anterior!). De acordo com o protocolo internacional, a amostra foi corada para identificar o clone HPN entre granulócitos, monócitos e eritrócitos, e de acordo com o método proposto pelos autores para identificar o clone HPN entre eritrócitos e reticulócitos. De acordo com o método proposto, a amostra foi corada com anticorpos monoclonais para CD235a(FITC)/CD59(PE)/CD71(APC), adicionando-os alternadamente a 40 μl de sangue total diluído 1:10.

Após incubação durante 15 minutos no escuro, as células foram lavadas duas vezes em 4 ml de solução salina tamponada com fosfato por centrifugação durante 5 minutos a 1500 rpm.

Após cada centrifugação, o sobrenadante foi recolhido, deixando as células no fundo do tubo.

A amostra preparada foi ressuspensa por 5 segundos em vórtice e 750 μl de PBS foram adicionados.

Para estudar eritrócitos e reticulócitos, a área de eritrócitos excluindo detritos e dupletos foi destacada no gráfico FSC(log) vs SSC(log).

Em seguida, o gráfico FSC(log) vs CD235a destacou células positivas para CD235a, excluindo detritos e células não pertencentes à população CD235a+ que ligaram de forma inespecífica anticorpos monoclonais a CD235a. Os eventos incluídos na porta CD235a+ foram analisados ​​no gráfico CD71 vs FSC(log), onde a população positiva para CD71 foi identificada.

Para uma avaliação objetiva do clone HPN entre os reticulócitos na porta CD71+, foram coletados pelo menos 20.000 eventos.

Dependendo da porta CD71+, um gráfico de FSC(log) vs SSC(log) foi traçado. Então, neste gráfico, usando uma porta adicional CD71str, foi isolada uma população de reticulócitos, que foi assim limpa de detritos e dupletos usando o método de gating sequencial.

Em seguida, no gráfico CD235a vs CD59, dependendo da porta CD71str (reticulócitos isolados), os reticulócitos foram avaliados quanto à presença da proteína CD59 ligada a GPI nas membranas de reticulócitos, respectivamente, células positivas para HPN e negativas para HPN. Os dados estatísticos foram refletidos em valores absolutos e% do portão.

Quando os reticulócitos foram isolados por CD71 e subsequentemente eliminados os detritos, a população de células CD59 ascendeu a 97,6%. Assim, utilizando o método proposto, foi detectado um clone da HPN.

O estudo segundo o protocolo internacional para detecção de HPN confirmou que o clone HPN está presente em granulócitos, monócitos e eritrócitos na quantidade de 99,2%, 97,6% e 71,0%, respectivamente, o que indica a reprodutibilidade dos resultados do proposto e métodos padrão. Este teste serviu de base para o diagnóstico de hemoglobinúria paroxística noturna.

Ensaios clínicos demonstraram que o método proposto possui alta confiabilidade, precisão e sensibilidade (0,1% clone HPN), permite determinar a presença tanto de valores elevados de clones em pacientes com hemoglobinúria paroxística noturna, quanto de valores menores (de 0,1 %) em pacientes com anemia aplástica, síndrome mielodisplásica. O método proposto é fácil de implementar, não requer grandes custos de material e um teste leva de 40 a 50 minutos.

A técnica é adequada para triagem de pacientes e está disponível para instituições médicas de diversos perfis, bem como para todas as categorias de cidadãos.

Um método para diagnóstico laboratorial de hemoglobinúria paroxística noturna, incluindo coloração do sangue total do paciente com anticorpos monoclonais em solução salina tamponada com fosfato, incubação, lavagem de células sanguíneas de anticorpos monoclonais não ligados por centrifugação, ressuspensão da amostra finalizada, avaliação subsequente do tamanho do clone ou sua ausência no programa do citômetro de fluxo de acordo com a ausência ou presença de proteínas protetoras, caracterizado por ser utilizada uma combinação tricolor de anticorpos monoclonais CD235a (FITC)/CD59(PE)/CD71 (APC) para corar o amostra de sangue em estudo, que é adicionada ao tubo de ensaio com a amostra, a presença do clone HPN entre eritrócitos e reticulócitos é avaliada com base na ausência da proteína protetora CD59 na membrana dos reticulócitos isolados pela porta CD235a - um pan- marcador eritrocitário e receptor de transferrina CD71-, para avaliar o clone HPN entre os reticulócitos na porta CD71+, são coletados pelo menos 20.000 eventos, dependendo da porta CD71+, é construído um gráfico FSC(log) vs SSC(log), no qual os reticulócitos são isolados usando uma porta adicional CD71str, purificando assim a população de reticulócitos de detritos e dupletos usando o método de gating sequencial, os valores indicadores obtidos são comparados com critérios normais, e na presença de 100% de reticulócitos CD59 positivos, a ausência de A HPN é julgada -clonar e diagnosticar a ausência da doença hemoglobinúria paroxística noturna se forem detectados reticulócitos CD59 negativos em um paciente com sintomas clínicos e o valor dos indicadores obtidos for superior a 1%, é dada uma conclusão diagnóstica sobre a presença de; o clone HPN e para confirmar o diagnóstico de hemoglobinúria paroxística noturna, recomenda-se um estudo adicional de acordo com o protocolo padronizado internacional, se forem detectados reticulócitos CD59 negativos e o valor dos indicadores obtidos for 0,1-1%, a presença de um menor O clone HPN é julgado e uma redeterminação do clone HPN é recomendada após 6 meses para aumento em seu valor e desenvolvimento de hemoglobinúria paroxística noturna, se esse tamanho for confirmado o clone é diagnosticado com uma forma subclínica de hemoglobinúria paroxística noturna sem clínica sinais.

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A invenção refere-se ao campo da medicina, nomeadamente da imunologia, e pode ser utilizada para avaliar a reação de transformação blástica de linfócitos. Para tanto, a brucelina é utilizada para ativar especificamente os linfócitos. A detecção de formas blásticas de linfócitos é realizada por meio de anticorpos monoclonais para CD34, seguida de contagem de células por citometria de fluxo. A utilização deste método permite a contagem de linfócitos ativados por brucelina em RBTL utilizando anticorpos monoclonais CD34 em pacientes com brucelose e doadores saudáveis. 1 mesa

A invenção refere-se à medicina, nomeadamente à imunologia, e pode ser utilizada para determinar anticorpos para HLA-G alogénico no soro sanguíneo. Para fazer isso, use um teste de correspondência cruzada entre as células mononucleares do doador e o soro do receptor. As subpopulações de células mononucleares são analisadas utilizando citometria de fluxo para a ligação de anticorpos monoclonais HLA-G e o grau de expressão de HLA-G é avaliado em células mononucleares de dadores experimentais e de controlo. Nesse caso, são significativas as subpopulações CD3-HLA-G+ e CD3+HLA-G+, a partir das quais o coeficiente de supressão (SC) no cenário experimental em relação ao controle é calculado pela fórmula: SR HLA-G = (H L A − G O P − H L A − G K O N T) H L A − G K O N T × 100, onde HLA-Gop é o número relativo total de subpopulações que expressam HLA-G: (CD3-HLA-G++CD3+HLA-G+) no cenário experimental, % ; HLA-Gcont - o número relativo total de subpopulações que expressam HLA-G: (CD3-HLA-G++CD3+HLA-G+) na configuração de controle, %. Nesse caso, a presença de sensibilização ao HLA-G alogênico é diagnosticada com valor KPHLA-G negativo. A utilização desse método permite detectar a sensibilização alogênica ao HLA-G por citometria de fluxo, determinando as subpopulações CD3-HLA-G+ e CD3+HLA-G+. 3 pr., 3 il., 2 abas.

A invenção refere-se ao campo da medicina, nomeadamente à obstetrícia e à ginecologia, e pode ser utilizada para prever a recorrência de uma ameaça de aborto espontâneo. Para fazer isso, um estudo imunológico do sangue venoso periférico é realizado entre 7 e 12 semanas de gestação em mulheres com ameaça de aborto espontâneo. Após o tratamento de ameaças de aborto espontâneo, é determinado o conteúdo relativo de CD45RA-CD62L- na população de linfócitos CD8+. Quando seu valor é superior a 23,9%, prevê-se a ocorrência de ameaça de aborto espontâneo no segundo trimestre em mulheres com histórico de aborto espontâneo de repetição. A utilização deste método permite prever a recorrência de uma ameaça de aborto espontâneo no segundo trimestre de gestação, o que permitirá escolher as táticas corretas para o manejo da gestante e reduzir a incidência dessa complicação. 1 aba., 4 avenida.

A invenção refere-se à medicina, nomeadamente à transfusiologia, e pode ser utilizada para monitorizar a eficácia da irradiação do sangue do doador. O método inclui o estadiamento da reação de transformação blástica das células sanguíneas com o mitógeno fitohemaglutinina e a consideração dos resultados da reação através da determinação do índice de estimulação de linfócitos. A reação é realizada em relação ao sangue do doador irradiado, os resultados são registrados em citofluorímetro de fluxo utilizando anticorpos monoclonais marcados com diferentes fluorocromos, gating de linfócitos ativados com expressão reduzida do marcador leucocitário comum CD45 e determinação da porcentagem de T duplo-negativo -linfócitos com o imunofenótipo CD3+ entre eles CD4-CD8-, enquanto uma amostra não irradiada do mesmo sangue é retirada como controle. Depois disso, a eficácia da irradiação é determinada pela proporção do conteúdo de linfócitos T duplo-negativos com o imunofenótipo CD3+CD4-CD8- no sangue testado irradiado e no mesmo sangue controle não irradiado como Eob=Sdntlo-Sdntlk, onde Eob é a eficácia da irradiação, Cdntlo é a porcentagem de conteúdo duplicado de linfócitos T negativos com o imunofenótipo CD3+CD4-CD8- no experimento (no sangue irradiado testado), Cdntlk - a porcentagem de T- duplo negativo. linfócitos com imunofenótipo CD3+CD4-CD8- no controle (em amostra não irradiada do mesmo sangue). Se a diferença com o controle for superior a 50%, conclui-se sobre a inferioridade funcional dos linfócitos T no sangue irradiado e a segurança imunológica deste hemoderivado para o receptor. A utilização deste método permite determinar a eficácia da irradiação do sangue do doador por meio da citometria de fluxo.

A invenção refere-se à medicina, nomeadamente à obstetrícia e à ginecologia, e permite prever a ameaça de aborto espontâneo tardio em mulheres grávidas. Para fazer isso, às 5-12 semanas de gestação, é determinado o número relativo de monócitos gestacionais CD178+ no sangue venoso periférico. Quando seu valor é igual a 37,7% ou menos na porta monocítica, prevê-se uma ameaça de aborto espontâneo tardio em mulheres com ameaça de aborto precoce e histórico de aborto recorrente. A utilização deste método permite escolher as táticas corretas de manejo da gravidez, realizar um conjunto de medidas terapêuticas e preventivas e reduzir o risco de complicações e resultados adversos da gravidez em um grupo de mulheres com alto risco de aborto espontâneo. 3 avenida, 1 guia.

A invenção refere-se à medicina, nomeadamente à obstetrícia, e diz respeito à escolha de táticas para o manejo de mulheres grávidas com insuficiência placentária e síndrome de restrição de crescimento fetal (FGR). Para tanto, em pacientes com insuficiência fetoplacentária e FGR, a atividade da superóxido dismutase, o conteúdo do fator de crescimento placentário, endoglina e melatonina são determinados no soro sanguíneo pelo método de imunoensaio enzimático. Com base nesses indicadores, o coeficiente prognóstico P é calculado pela fórmula: P = (0,0001*COD+0,0255*Mel+0,1636*CD105+(-0,0487*PGF)-8,5389, onde COD é superóxido dismutase, pg/ ml, Mel - melatonina, pg/ml, CD 105 - endoglin, pg/ml, PGF - fator de crescimento placentário, pg/ml Com valor P de 0,64 ou mais, há alto risco de desenvolver uma condição crítica do feto no período pré-natal. previsto, o que requer a interrupção da gravidez por cesariana de emergência no interesse do feto. O método fornece maior precisão na previsão da condição crítica do feto no período pré-natal, o que permite a seleção oportuna de táticas adequadas para o manejo do paciente.

A invenção refere-se à área da medicina, nomeadamente à otorrinolaringologia, e pode ser utilizada para diagnóstico diferencial expresso de amigdalites virais e bacterianas agudas em adultos. Para fazer isso, o sangue periférico é coletado e o conteúdo relativo de subpopulações de granulócitos neutrófilos que expressam simultaneamente CD16 e CD11b na membrana superficial é determinado. A presença de uma subpopulação CD16brightCD11bdimNG% de 80 a 99,9% com alta densidade de expressão de CD16 e baixa densidade de expressão de CD11b é aceita como normal. Se uma subpopulação de CD16brightCD11bbrightNG ou CD16dimCD11bbrightNG for detectada em uma quantidade de 40% ou mais, uma infecção viral aguda ou uma infecção bacteriana aguda será determinada, respectivamente. A utilização deste método permite garantir a precisão do diagnóstico diferencial de amigdalites virais e bacterianas agudas em adultos. 3 avenida, 1 guia.

O grupo de invenções refere-se à medicina, nomeadamente ao diagnóstico laboratorial, e pode ser utilizado para a identificação simultânea de representantes de grupos taxonómicos convencionais de microrganismos patogénicos para humanos e animais. Caracteriza-se pela utilização de pelo menos cinco tiras imunocromatográficas alojadas em um único corpo. Ao mesmo tempo, no primeiro e segundo canais do corpo do dispositivo existem testes de tira para identificação de toxinas, no terceiro canal - um teste de tira para identificação de formas vegetativas de bactérias, no quarto - formas de esporos de bactérias, e no quinto - um teste de tira para identificar um meio nutriente para o cultivo de vírus e riquétsias. O teste é realizado colocando o corpo dos testes de tira imunocromatográfica em um saco Zeflen com isolamento térmico, composto por duas camadas de Zeflen, com uma junta isolante de calor feita de material isolante térmico poroso entre elas, e o corpo dos testes de tira imunocromatográfica o interior da bolsa é aquecido com uma fonte de calor constante, e a abertura da bolsa é fechada com uma pinça mecânica e Considere este momento como o início do teste. Também é proposto um dispositivo para análise imunocromatográfica. O conjunto de invenções permite aumentar a produtividade da análise imunocromatográfica, ampliar a faixa de temperatura da análise imunocromatográfica de menos 20 para mais 50°C, reduzir o tempo de obtenção dos resultados para 10 minutos em relação à análise à temperatura ambiente (20 minutos) , desde que a mesma sensibilidade seja alcançada, e aumente a sensibilidade da análise em comparação com a análise realizada à temperatura ambiente. 2 n. e 7 salário fly, 5 il., 4 mesas, 8 pr.

A invenção refere-se à medicina, nomeadamente ao diagnóstico laboratorial, e pode ser utilizada para o diagnóstico da hemoglobinúria paroxística noturna. Para isso, a amostra de sangue em estudo é corada com anticorpos monoclonais CD235a CD59CD71. A presença de um clone de HPN entre eritrócitos e reticulócitos é avaliada pela ausência da proteína protetora CD59 na membrana dos reticulócitos isolados pela porta CD235a - marcador pan-eritrocitário e CD71 - receptor de transferrina. Para avaliar o clone HPN entre reticulócitos na porta CD71+, são coletados pelo menos 20.000 eventos, dependendo da porta CD71+, é construído um gráfico FSC vs SSC, no qual os reticulócitos são isolados usando a porta adicional CD71str, eliminando assim a população de reticulócitos de detritos e dupletos usando o método de gating sequencial. Se houver 100 reticulócitos positivos para CD59, avalia-se a ausência de um clone HPN e diagnostica-se a ausência de hemoglobinúria paroxística noturna. Se forem detectados reticulócitos CD59 negativos em um paciente com sintomas clínicos e o valor dos indicadores obtidos for superior a 1, é dada uma conclusão diagnóstica sobre a presença de um clone de HPN e para confirmar o diagnóstico de hemoglobinúria paroxística noturna, um estudo adicional é recomendado de acordo com o protocolo padronizado internacional. Se forem detectados reticulócitos negativos para CD59 e o valor dos indicadores obtidos for 0,1-1, avalia-se a presença de um clone menor de HPN e recomenda-se redeterminar o clone de HPN após 6 meses para verificar se há um aumento em seu valor e o desenvolvimento de hemoglobinúria paroxística noturna, e se o tamanho deste clone for confirmado É diagnosticada uma forma subclínica de hemoglobinúria paroxística noturna sem sinais clínicos. O uso de controle multiparâmetro de células CD71+ torna possível excluir da análise detritos, dupletos e anticorpos monoclonais ligados de forma inespecífica. 1 doente.

Os materiais são apresentados no livro didático RUDN

Anemia. Clínica, diagnóstico e tratamento / Stuklov N.I., Alpidovsky V.K., Ogurtsov P.P. – M.: Agência de Informação Médica LLC, 2013. – 264 p.

Copiar e reproduzir materiais sem indicação dos autores é proibido e punível por lei.

A hemoglobinúria paroxística noturna (HPN) é uma anemia hemolítica clonal adquirida associada a um defeito na membrana das células sanguíneas, portanto a doença é considerada no grupo das membranopatias e é a única membranopatia adquirida entre as doenças desse grupo. A mutação que leva ao defeito da membrana na HPN ocorre ao nível da célula-tronco pluripotente, e a causa da mutação permanece obscura.

A HPN ocorre com frequência de 1:500.000 da população. Pessoas de todas as faixas etárias ficam doentes, mas com mais frequência – entre 30 e 40 anos. Homens e mulheres adoecem com a mesma frequência.

Etiologia e patogênese

Mutação genética pontual PIGA no cromossomo 22 ou no cromossomo X de uma célula-tronco pluripotente (PSC) leva à interrupção da formação de ácido fosfatidilinolínico e proteínas na superfície das células sanguíneas CD 55 e CD 59, formando um sistema nas células normais que bloqueia o efeito prejudicial na membrana do complemento ativado devido à formação de uma cascata CD 5b –9 – um complexo que afeta proteoliticamente a membrana celular.

Assim, a ausência de fatores na superfície das células sanguíneas que interfiram na função do complemento leva à lise de eritrócitos, neutrófilos e plaquetas defeituosos.

Na HPN, existem dois clones no sangue dos pacientes: normal e patológico, e o quadro clínico e a gravidade da doença dependem em grande parte da proporção desses clones.

Clínica

A ação proteolítica do complemento ativado leva à destruição intravascular dos glóbulos vermelhos defeituosos, que se manifesta hemoglobinúria. A ativação do complemento ocorre à noite durante o sono, devido a uma mudança no pH para o lado ácido.

Clinicamente, a hemólise durante o sono se manifesta pela liberação de urina preta durante a diurese matinal, queixas de mal-estar, tontura e aparecimento de amarelecimento da esclera. Além disso, a hemólise pode ser provocada por doenças infecciosas e certos medicamentos.

Além dos sintomas anêmicos associados à hemólise, a HPN desempenha um papel importante na clínica. complicações trombóticas, causada pela liberação de tromboplastina e uma série de enzimas ativas de células destruídas.

Muitas vezes, uma das primeiras queixas do paciente é dor abdominal, simulando diversas patologias abdominais agudas. A dor abdominal está associada à trombose de pequenas artérias mesentéricas.

Tromboflebiteocorre em 12% dos pacientes com HPN e pode ocorrer de diferentes maneiras. Em uma das opções, o estado dos pacientes fora das crises é bastante satisfatório, o conteúdo Hb – cerca de 80 – 90 g/l. Em outros pacientes, ocorrem crises hemolíticas graves, uma após a outra, levando à anemia grave. Muitas vezes são acompanhados de complicações trombóticas.

Dados laboratoriais

Durante uma crise hemolítica, pode ser observada uma diminuição acentuada nos níveis de hemoglobina para 20 g/l ou menos, e uma diminuição paralela no número de glóbulos vermelhos. Durante o período de remissão, o conteúdo Hb e os eritrócitos aumentam, no entanto, em casos raros, atinge o limite inferior do normal. Ao contrário da maioria das membranopatias, um defeito na membrana eritrocitária na HPN não é acompanhado por alterações características na forma dos eritrócitos patológicos. A anemia, na maioria dos casos, é de natureza normocítica e normocrômica. No entanto, com perda significativa de ferro na urina (como resultado de hemoglobinúria e hemossiderinúria), desenvolve-se hipocromia dos eritrócitos. O conteúdo de reticulócitos está aumentado, mas em muito menor grau do que nas membranopatias congênitas com intensidade semelhante de hemólise. Hemoglobinas anormais e diminuição da atividade enzimática (exceto acetilcolinesterase) não foram detectadas em eritrócitos na HPN. A resistência osmótica dos eritrócitos não é alterada. Quando eritrócitos de pacientes com HPN são incubados em condições estéreis, observa-se auto-hemólise maior que o normal, que, no entanto, não diminui com a adição de glicose.

O número de leucócitos na maioria dos casos é reduzido devido à neutropenia. Às vezes há um desvio para a esquerda no leucograma.

A contagem de plaquetas também costuma ser baixa. As funções plaquetárias não são prejudicadas.

Ao examinar a medula óssea, são detectadas hiperplasia eritróide e sinais de deficiência de hematopoiese da medula óssea na forma de amadurecimento prejudicado de glóbulos vermelhos e elementos granulocíticos, bem como uma diminuição no número de megacariócitos, muitas vezes com ligação prejudicada de plaquetas sanguíneas. Em alguns pacientes com HPN, juntamente com sinais de dishematopoiese, é detectada hipoplasia da medula óssea, característica da anemia aplástica.

Nos casos em que eritrócitos HPN sensíveis ao complemento e sintomas de hemólise intravascular são detectados em pacientes com aplasia hematopoiética previamente estabelecida, é diagnosticada a síndrome HPN, que se desenvolveu no contexto de anemia aplástica.

No entanto, deve-se lembrar dos raros casos de HPN, que terminam em anemia aplástica devido à depleção da hematopoiese da medula óssea por crises hemolíticas graves e outros efeitos adversos (infecções, certos medicamentos, etc.).

Um importante sinal laboratorial de HPN é a hemoglobinúria. O conteúdo de hemoglobina livre no plasma devido à destruição intravascular de eritrócitos na HPN, dependendo da gravidade da hemólise, varia de 11 a 280 mg% (com norma de até 4 mg%).

O conteúdo de bilirrubina geralmente está ligeiramente aumentado, principalmente devido à fração não conjugada. O nível de ferro sérico na HPN depende da fase da doença: durante as crises hemolíticas, devido à liberação de ferro da hemoglobina no plasma, observa-se ferritinemia, e durante um período de silêncio, devido à perda de ferro na urina, hipoferritinemia é observada. A deficiência de ferro na HPN, em contraste com a anemia ferropriva, é acompanhada por uma diminuição simultânea na capacidade total e latente de ligação do ferro, aparentemente devido a uma violação da síntese de transferrina no fígado.

O exame de urina revela hemoglobinúria na maioria dos pacientes com HPN. Com a HPN, a hemoglobina aparece na urina em sua concentração plasmática relativamente baixa, o que está associado a uma diminuição no conteúdo de haptoglobina plasmática. Durante a excreção da hemoglobina pelos rins, parte dela é reabsorvida e depositada no epitélio tubular na forma de hemossiderina, que é então excretada na urina. Curiosamente, a hemossiderinúria na HPN pode ser detectada com mais frequência do que a hemoglobinúria, uma vez que também se desenvolve fora de uma crise hemolítica.

DiagnósticoA doença está associada à identificação de quadro clínico característico, sinais laboratoriais de hemólise intravascular (hemoglobinemia (cor vermelha do soro sanguíneo após centrifugação), diminuição da haptoglobina no sangue, leve bilirrubinemia indireta, aumento de LDH, hemoglobinúria, hemossiderinúria). O diagnóstico da HPN baseia-se na detecção de eritrócitos sensíveis ao complemento característicos desta doença. Para isso são usados Teste de ácido hema e mais sensível teste de sacarose.

Ao realizar o teste de Hem, os glóbulos vermelhos testados são incubados em soro normal acidificado a pH 6,4. Nestas condições, apenas os eritrócitos sensíveis ao complemento são lisados. Deve-se lembrar que com baixo teor de hemácias HPN no sangue do paciente e com baixa atividade do complemento no soro, o teste de Hem pode dar resultados negativos.

Mais sensível é o teste de sacarose, no qual os glóbulos vermelhos testados e uma pequena quantidade de soro normal são colocados em uma solução isotônica de sacarose. Sob condições de voltagem reduzida em um ambiente de sacarose, ocorre uma fixação mais ativa do complemento na superfície dos eritrócitos e a lise dos eritrócitos HPN sensíveis ao complemento.

A evidência da presença de um clone HPN é a detecção na membrana celular de sinais característicos de lesão do gene PIG A. Métodos modernos de citometria de fluxo permitem determinar a presença de eritrócitos com deficiência total ou parcial de moléculas CD59. membrana, porém, os eritrócitos patológicos nem sempre podem ser detectados, dada a presença de sua hemólise pronunciada. O mais confiável é o estudo dos granulócitos monócitos, uma vez que as células nucleadas são menos suscetíveis à ação do complemento.

Tratamento

Devido à falta de ideias claras sobre a patogênese da HPN, o tratamento desta doença é atualmente sintomático.

Para combater a anemia, são utilizadas transfusões de sangue de reposição, cuja frequência depende da gravidade da hemólise e da atividade compensatória da medula óssea. Deve-se lembrar que a transfusão de sangue total fresco para pacientes com HPN é frequentemente acompanhada de aumento da hemólise. A razão para esta reação não é clara. Pacientes com HPN toleram melhor transfusões de sangue total ou hemácias com longos períodos de armazenamento (mais de 7 a 8 dias) e transfusões de hemácias lavadas 3 a 5 vezes, liberadas de leucócitos e plaquetas. A utilização de hemácias lavadas é o melhor método transfusional no tratamento da HPN. Quando ocorre uma reação às hemácias lavadas devido ao desenvolvimento de isossensibilização, é necessária a seleção individual do doador de acordo com a reação indireta de Coombs (Fig. 12).

Um lugar importante no tratamento da HPN é ocupado por suplementos de ferro e hormônios androgênicos. A terapia com suplementos de ferro é recomendada para pacientes com HPN quando são detectadas hipocromia eritrocitária e diminuição dos níveis séricos de ferro durante o curso tranquilo da doença. Os suplementos de ferro devem ser usados ​​com cuidado (em pequenas doses e apenas mas ), pois é conhecida sua capacidade de provocar crises hemolíticas graves em alguns pacientes com HPN.

O uso de andrógenos na HPN baseia-se no efeito estimulante desses hormônios na eritropoiese. A administração de Nerabol ou seus análogos na dose de 30–40 mg/dia promove uma recuperação mais rápida dos níveis de hemoglobina após um episódio hemolítico e, assim, reduz significativamente a necessidade de transfusões de sangue. O uso de andrógenos é especialmente eficaz na HPN com hipoplasia hematopoiética.

As táticas de tratamento das complicações trombóticas dependem da localização da trombose, da sua duração e do estado do sistema de coagulação. Nos casos em que esta complicação ameaça a vida do paciente, é necessária a utilização de terapia trombolítica e anticoagulante complexa (fibrinolisina ou uroquinase, ácido nicotínico, heparina e anticoagulantes indiretos) de acordo com as regras terapêuticas gerais e em dosagens suficientes.

Como há relatos de aumento de hemólise após administração de heparina, esse anticoagulante deve ser utilizado com muita cautela.

A esplenectomia para HPN não está indicada, pois o pós-operatório costuma ser complicado por trombose dos vasos mesentéricos. O risco da cirurgia é aceitável apenas na presença de sintomas graves de hiperesplenismo: leucopenia profunda, complicada por infecções frequentes e/ou trombocitopenia, acompanhada de síndrome hemorrágica grave.

Foi desenvolvido um medicamento de moderna tecnologia genética Eculizumab (Soliris, SOLIRIS®), registrado pelo FDA (Food and Drug Administration) para o tratamento de crianças e adultos que sofrem de HPN. Eculizumabe é um anticorpo monoclonal humanizado glicosilado - imunoglobulina kappa (IgG2/4k) que se liga à proteína C5 do complemento humano e inibe a ativação da lise celular mediada pelo complemento. O anticorpo consiste em regiões constantes de imunoglobulina humana e regiões determinadas complementares de imunoglobulina de camundongo incorporadas nas regiões variáveis ​​das cadeias leves e pesadas do anticorpo humano. Eculizumabe contém duas cadeias pesadas de 448 aminoácidos cada e duas cadeias leves de 214 aminoácidos cada. O peso molecular é 147.870 Da. O eculizumabe é produzido em linhagem celular de mieloma murino cultivada NS0 e purificado usando cromatografia de afinidade e troca iônica. O processo de produção da substância também inclui processos de inativação e remoção específica de vírus.

O eculizumabe suprime a atividade terminal do complemento humano, possuindo alta afinidade pelo seu componente C5. Como consequência, a clivagem do componente C5 em C5a e C5b e a formação do complexo terminal do complemento C5b-9 são completamente bloqueadas. Assim, o eculizumabe restaura a regulação da atividade do complemento no sangue e previne a hemólise intravascular em pacientes com HPN. Por outro lado, a deficiência terminal de complemento é acompanhada por um aumento na incidência de infecções por microrganismos encapsulados, principalmente infecção meningocócica. Ao mesmo tempo, o eculizumabe mantém o conteúdo de produtos de ativação precoce do complemento necessários para a opsonização de microrganismos e a remoção de complexos imunes. A prescrição de Soliris aos pacientes é acompanhada por uma diminuição rápida e estável na atividade terminal do complemento. Na maioria dos pacientes com HPN, uma concentração plasmática de eculizumabe de cerca de 35 μg/ml é suficiente para inibir completamente a hemólise intravascular induzida pela ativação terminal do complemento.

Graças aos novos resultados clínicos únicos e à abertura de oportunidades terapêuticas para os médicos preservarem a vida e a saúde plenas dos pacientes, o Eculizumab foi registado de forma acelerada, sem a realização de uma terceira fase de ensaios clínicos - isto irá salvar muitas vidas, tanto crianças como adultos.

Neste sentido, após o registo nos EUA, o Comité Europeu de Medicamentos emitiu um parecer positivo sobre o registo acelerado do Eculizumab na Europa, o que também é esperado num futuro próximo.

Considerando o alto custo do eculizumabe, a impossibilidade de seu uso para influenciar a causa da doença e o fato de que deve ser usado por toda a vida, uma estratégia de reserva é mais aplicável a ele, destinada especificamente a pacientes com elevado número de células HPN ou para pacientes com tendência à formação de trombos, independentemente do tamanho do clone PNG.

Atualmente, o único tratamento radical para a HPN é o transplante alogênico de medula óssea.

Curso e prognóstico

O prognóstico depende da gravidade da doença de base, piorando em pacientes dependentes de transfusões sanguíneas, com trombose grave. Em 10% dos pacientes observam-se remissões espontâneas da doença, em outros ela se transforma em anemia aplástica, SMD, e em 5% - em leucemia aguda. Em média, a esperança de vida é de 10 a 15 anos.

A HPN é uma doença crônica e atualmente completamente incurável. A gravidade da HPN e o prognóstico dependem em grande parte do tamanho da população de eritrócitos sensíveis ao complemento, da capacidade compensatória da medula óssea e da ocorrência de complicações, especialmente trombose venosa. A ideia de um prognóstico grave para HPN mudou recentemente devido à introdução da terapia sintomática ativa.

Tem aumentado o número de pacientes que estão em estado de compensação clínica e hematológica há muito tempo e levam um estilo de vida normal neste momento. A incidência de trombose grave e com risco de vida diminuiu. Em alguns pacientes, ao longo do tempo, ocorre uma atenuação da doença com diminuição da proporção de eritrócitos sensíveis ao complemento. Em casos raros, é descrito o desaparecimento completo dos glóbulos vermelhos patológicos, o que indica a possibilidade fundamental de cura da doença.

A hemoglobinúria paroxística noturna (HPN) é uma doença adquirida que se manifesta por anemia hemolítica persistente, hemoglobinúria paroxística ou persistente e hemólise intravascular. A raridade deste tipo de anemia hemolítica é caracterizada pelo fato de a HPN afetar 1 pessoa em meio milhão, principalmente jovens.

As causas da doença são atualmente desconhecidas. Supõe-se que ocorra devido à ocorrência de um clone anormal de hemácias com tendência à hemólise intravascular. Por sua vez, a inferioridade dos glóbulos vermelhos é consequência de defeitos estruturais e bioquímicos na sua membrana. Sabe-se que a peroxidação lipídica é ativada em uma membrana defeituosa, o que promove a rápida lise das hemácias, além disso, clones anormais de granulócitos e plaquetas estão envolvidos no processo patológico; O principal papel na ocorrência de complicações trombóticas da HPN pertence à destruição intravascular dos eritrócitos e ao início da coagulação sanguínea por fatores liberados durante esse processo. A HPN, via de regra, inicia-se gradativamente e prossegue cronicamente com crises periódicas. As crises são provocadas por infecções virais, intervenções cirúrgicas, estresse psicoemocional, menstruação e uso de diversos medicamentos e alimentos.

Sintomas de hemoglobinúria paroxística noturna

Sintomas de HPN durante uma crise:

• dor paroxística na cavidade abdominal;
• dor na região lombar;
• icterícia da pele e esclera; hipertermia; pastosidade facial;
• cor preta da urina, principalmente à noite;
• uma diminuição acentuada da pressão arterial;
• aumento transitório do baço;
• cessação da produção de urina.

Em alguns casos, a crise hemolítica termina em morte.

Sintomas de HPN fora da crise:

• fraqueza geral;
• pele pálida com tonalidade ictérica;
• anemia;
• tendência à trombose; hematúria; pressão alta; aumento do fígado; dispneia; batimento cardiaco; doenças infecciosas frequentes.

Diagnóstico

• Exame de sangue: anemia (normocrômica, posteriormente hipocrômica), leucocitopenia e trombocitopenia moderadas, o nível de ferro sérico é significativamente reduzido.
• Exame de urina: coloração preta, hemoglobinúria, hemossiderinúria, proteinúria. O teste de benzidina na urina de Gregersen é positivo.
• O teste específico de Ham é positivo.
• O teste específico de Hartmann é positivo.
• Punção da medula óssea: hiperplasia da linhagem hematopoiética vermelha, mas em casos graves também pode ser observada hipoplasia da medula óssea e aumento da quantidade de tecido adiposo na medula óssea.

Tratamento da hemoglobinúria paroxística noturna

O tratamento da HPN é sintomático e consiste principalmente em transfusões de sangue de reposição, cujo volume e frequência dependem da “resposta” a essas medidas. No tratamento da HPN, a metandrostenolona é utilizada na dose de 30-50 mg/dia por pelo menos 2-3 meses. O combate à hipoplasia da medula óssea é feito por meio do uso intravenoso de imunoglobulina antitimócito na dose de 150 mg/dia por 4 a 10 dias. Recomenda-se tomar suplementos de ferro por via oral em pequenas dosagens. Às vezes, os corticosteróides em altas dosagens têm um bom efeito. A hipoplasia da medula óssea com desenvolvimento de complicações trombóticas são indicações para seu transplante. Foram descritos casos isolados de recuperação da HPN, em alguns casos, a duração de um curso favorável da doença é de várias décadas;

Medicamentos essenciais

Existem contra-indicações. É necessária consulta especializada.

Esta patologia do sistema hematopoiético, conhecida como anemia de Marchiafava-Micheli, está associada a uma perturbação da estrutura das membranas dos glóbulos vermelhos, o que leva à sua morte prematura. Como resultado de um desequilíbrio entre células jovens e maduras, pode ocorrer anemia, o que afeta o desempenho de todos os sistemas vitais. A hemólise prematura é uma patologia genética, mas não é hereditária, por isso é importante saber como lidar com esta doença. Como se manifesta a hemoglobinúria paroxística noturna e como é tratada?

A hemoglobinúria está associada ao aparecimento de uma mutação no gene PIG-A, localizado no cromossomo X. Ninguém sabe por que isso acontece.

O processo de mutação ocorre em um nível tão micro que mesmo as tecnologias modernas não conseguem determinar a causa da patologia.

A síntese de todas as células do sistema circulatório ocorre na medula óssea. Se uma unidade eritrocitária mutagênica estiver presente, todas as células produzidas herdarão o defeito. A razão para isso é a divisão constante da célula inicialmente “errada”.

A peculiaridade da doença é que a membrana das hemácias não contém moléculas proteicas especiais que protejam a célula da hemólise prematura causada pelo processo constante e contínuo de complementação. Isto, por sua vez, provoca a destruição dos glóbulos vermelhos e a libertação de hemoglobina livre no sangue, o que tem consequências negativas.

A mutação genética leva ao fato de os glóbulos vermelhos morrerem antes de completarem sua função principal. Sua hemólise não está associada à influência de fatores externos, estilo de vida humano, hábitos e hereditariedade.

Apesar de a doença não ter cura total, existe uma terapia corretiva com a qual você pode levar um estilo de vida normal.

Prevalência

A hemoglobinúria paroxística noturna geralmente se manifesta aos 35-45 anos de idade. As manifestações na infância e adolescência são consideradas muito raras e são diagnosticadas com frequência de um caso a cada 10-15 anos.

A doença é extremamente rara e não depende de sexo, raça ou região de residência. Apenas 1-2 casos por milhão de pessoas são registrados anualmente.

Faça sua pergunta a um médico de diagnóstico laboratorial clínico

Anna Poniaeva. Ela se formou na Academia Médica de Nizhny Novgorod (2007-2014) e Residência em Diagnóstico Laboratorial Clínico (2014-2016).

Causas

É impossível determinar com segurança o que exatamente desencadeou o desenvolvimento de uma doença genética, uma vez que esse processo está além do controle da medicina. No entanto, foi cientificamente estabelecido que quando a anemia aplástica é diagnosticada, os riscos de desenvolver hemoglobinúria aumentam dez vezes.

Existe também uma relação entre a anemia aplástica nos pais e no feto e a manifestação tardia de hemoglobinúria noturna na criança.

Grupos de risco e fatores predisponentes, infelizmente, não podem ser estabelecidos, uma vez que a doença se manifestou em diferentes categorias da população com diferentes estilos de vida.

Classificação

A hemoglobinúria paroxística noturna tem várias formas de manifestação:

Subclínico– caracterizada pela ausência de sintomas agudos, bem como pela capacidade de desaparecer por conta própria. É determinado pela presença de um pequeno número de glóbulos vermelhos defeituosos, conforme demonstrado por um exame clínico de sangue. Externamente, pode ser acompanhada de fraqueza constante, falta de ar, tonturas e dores abdominais sem causa que desaparecem por si mesmas.

Clássico– tem quadro clínico mais acentuado, já que a mutação atinge não só as hemácias, mas também outras frações do sangue, o que agrava o estado de saúde do paciente.

Estudos mostram que o mecanismo de hematopoiese (síntese de novas células pelas estruturas ósseas) não é prejudicado, enquanto a composição quantitativa e qualitativa do sangue apresenta desvios significativos.

Associado a distúrbios de hematopoiese– caracterizada pela presença de curso agudo e rápida deterioração do bem-estar geral do paciente. A causa é uma deficiência do sistema hematopoiético, que se desenvolve devido a doenças prévias e complicadas com o uso de medicamentos potentes.

Catad_tema Doenças do sangue - artigos

CID 10: D61.1, D61.2, D61.3, D61.8, D61.9

Ano de aprovação (frequência de revisão): 2014 (revisado a cada 2 anos)

EU IA: KR121

Associações profissionais:

• Sociedade Nacional de Hematologia

Aprovado

Sociedade Russa de Hematologistas

Acordado

Conselho Científico do Ministério da Saúde da Federação Russa__ __________201_

Critérios de qualidade

Nível de evidência

Medidas de diagnóstico

Realize um exame de sangue clínico avançado

Estudos morfológicos e citoquímicos da preparação da medula óssea foram realizados

Um estudo citogenético de células da medula óssea foi realizado

Foi realizado um estudo morfológico (histológico) de uma preparação de medula óssea

Foi realizada radiografia de tórax e/ou tomografia computadorizada de tórax e cérebro

Critérios de qualidade baseados em eventos (semântica, conteúdo, processo)

Um estudo morfológico e/ou histológico e/ou citogenético padrão de uma amostra de medula óssea foi realizado

Foi realizada terapia imunossupressora combinada (na ausência de contra-indicações)

A tipagem HLA dos irmãos foi realizada

Uma consulta foi realizada no centro de transplante dentro de 3 meses a partir do momento em que o curso refratário foi determinado

Critérios temporários de avaliação de qualidade

A terapia imunossupressora foi realizada dentro de 1 mês após a confirmação histológica e/ou citogenética do diagnóstico (na ausência de contraindicações médicas)

Os parâmetros clínicos e hematológicos foram avaliados durante a terapia pelo menos 2 vezes por semana até que uma resposta hematológica completa fosse alcançada

Um estudo morfológico de uma preparação de medula óssea foi realizado com avaliação da hematopoiese da medula óssea após a conclusão do programa de terapia

Foi realizado um estudo citogenético padrão de uma preparação de medula óssea (estudo de pelo menos 20 metáfases) e/ou um estudo de medula óssea utilizando hibridização fluorescente (caso o estudo citogenético não tenha sido informativo para identificar anormalidades características da síndrome mielodisplásica)

O clone da hemoglobinúria paroxística noturna foi determinado por citometria de fluxo altamente sensível a cada 6-12 meses, os sinais clínicos e laboratoriais de hemólise foram avaliados

Um estudo morfológico e/ou histológico e/ou citogenético padrão foi realizado antes da próxima etapa do tratamento

Um ciclo repetido de globulina antitimócita e tipagem HLA foi realizado (para determinar a disponibilidade de doadores de medula óssea alogênicos, na ausência de resposta após 3-6 meses)

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Apêndice A1. Composição do grupo de trabalho

Voitsekhovsky V.V. médico, Blagoveshchensk

Vopilina N.A. Hospital Clínico Regional GBUZ Tambov em homenagem. V.D. Babenko", Tambov

Gaponova TV. Candidato em Ciências Médicas, Diretor Geral Adjunto do Centro de Pesquisa Hematológica da Instituição Orçamentária do Estado Federal do Ministério da Saúde da Rússia, Moscou

Golubeva M.E.. "Centro Municipal de Hematologia" da Instituição Orçamentária Municipal de Saúde "GKP No. 5", Perm

Kaporskaya T.S. Candidato em Ciências Médicas, Chefe do Departamento de Hematologia, Ordem do Distintivo de Honra do Hospital Clínico Regional de Irkutsk, Irkutsk,

Klyasova G.A. Doutor em Ciências Médicas, Professor, Chefe do Laboratório Científico e Clínico de Microbiologia, Centro de Pesquisa Hematológica da Instituição Orçamentária do Estado Federal do Ministério da Saúde da Rússia, Moscou,

Konstantinova T.S. Chefe do Departamento de Hematologia, Centro Regional de Hematologia, Hospital Clínico Regional de Sverdlovsk No. 1, Yekaterinburg,

Kulagin A.D. Doutor em Ciências Médicas, Médico Chefe Adjunto da Clínica da Instituição Educacional Orçamentária do Estado de Educação Profissional Superior "Universidade Médica do Estado de São Petersburgo em homenagem. acadêmico. I.P. Pavlov" Ministério da Saúde da Rússia, Instituto de Pesquisa de Hematologia Pediátrica e Transplantologia de São Petersburgo em homenagem. R. M. Gorbacheva,

Lapin V.A. Candidato em Ciências Médicas, Chefe do Departamento de Hematologia, Hospital Clínico Regional de Yaroslavl, Yaroslavl

Mikhailova E.A. Doutor em Ciências Médicas, Professor, Pesquisador Principal do Departamento de Quimioterapia para Malignidades Hematológicas e Depressões Hematopoiéticas, Centro de Pesquisa Hematológica da Instituição Orçamentária do Estado Federal do Ministério da Saúde da Rússia, Moscou,

Parovichnikova E.N. Doutor em Ciências Médicas, Chefe do Departamento Científico e Clínico de Quimioterapia de Malignidades Hematológicas, Depressões Hematopoiéticas e Transplante de Medula Óssea, Centro de Pesquisa Hematológica da Instituição Orçamentária do Estado Federal do Ministério da Saúde da Rússia, Moscou,

Ploskikh M.A. GBUZ PC "Hospital Clínico Regional de Perm", Perm

Savchenko V.G. Acadêmico, Doutor em Ciências Médicas, Professor, Diretor Geral do Centro de Pesquisa Hematológica da Instituição Orçamentária do Estado Federal do Ministério da Saúde da Rússia, Moscou,

Samoilova O.S. Candidato em Ciências Médicas, Chefe do Departamento de Hematologia, Região de Nizhny Novgorod Hospital Clínico Regional de Nizhny Novgorod. N.A. Semashko, Nizhny Novgorod,

Skripkina N.S. hematologista GAUZ JSC "Hospital Clínico Regional de Amur", Blagoveshchensk,

Tikunova T.S. OGBUZ "Hospital Clínico Regional de Belgorod de St. Joasaph", Belgorod

Troitskaya V.V. Candidato em Ciências Médicas, Chefe do Departamento Científico e Clínico de Quimioterapia de Malignidades Hematológicas e Depressões de Hematopoiese, Centro Científico Hematológico da Instituição Orçamentária do Estado Federal do Ministério da Saúde da Rússia, Moscou,

Ustinova E.N. Candidato em Ciências Médicas, Pesquisador do Departamento de Quimioterapia para Malignidades Hematológicas e Depressões de Hematopoiese, Centro de Pesquisa Hematológica da Instituição Orçamentária do Estado Federal do Ministério da Saúde da Rússia, Moscou,

Chagorova T.V. Instituição Orçamental de Saúde do Estado "Dispensário Regional de Oncologia", Penza

Especialistas em hematologia;

Especialistas em oncologia;

Terapeutas especializados;

Metodologia de coleta de evidências

Métodos utilizados para coleta/seleção de evidências: busca em bases de dados eletrônicas.

Descrição dos métodos utilizados para coleta/seleção de evidências: a base de evidências para as recomendações são publicações incluídas na Biblioteca Cochrane, nas bases de dados EMBASE e MEDLINE. A profundidade da pesquisa foi de 10 anos.

Níveis de evidência	Descrição
	Metanálises de alta qualidade, revisões sistemáticas de ensaios clínicos randomizados (ECR) ou ECRs com risco muito baixo de viés
	Metanálises bem conduzidas, sistemáticas ou ECRs com baixo risco de viés
	Metanálises, sistemáticas ou ECRs com alto risco de viés
	Revisões sistemáticas de alta qualidade de estudos de caso-controle ou de coorte. Revisões de alta qualidade de estudos de caso-controle ou de coorte com risco muito baixo de efeitos de confusão ou viés e probabilidade moderada de causalidade
	Estudos de caso-controle ou de coorte bem conduzidos com risco moderado de efeitos de confusão ou viés e probabilidade moderada de causalidade
	estudos de caso-controle ou de coorte com alto risco de efeitos de confusão ou viés e probabilidade moderada de causalidade
	Estudos não analíticos (por exemplo: relatos de casos, séries de casos
	Opinião de um 'expert

Métodos utilizados para avaliar a qualidade e a força da evidência:

Consenso de especialistas;

Métodos usados ​​para analisar evidências:

Revisões sistemáticas com tabelas de evidências.

Descrição dos métodos utilizados para analisar evidências:

Ao selecionar publicações como potenciais fontes de evidência, a metodologia utilizada em cada estudo é examinada para garantir sua validade. O resultado do estudo influencia o nível de evidência atribuído à publicação, que por sua vez influencia a força das recomendações dela resultantes.

O exame metodológico baseia-se em várias questões-chave que se concentram nas características do desenho do estudo que têm um impacto significativo na validade dos resultados e conclusões.

O processo de avaliação pode, sem dúvida, ser afetado pelo fator subjetivo. Para minimizar possíveis vieses, cada estudo foi avaliado de forma independente, ou seja, pelo menos dois membros independentes do grupo de trabalho. Quaisquer diferenças nas avaliações foram discutidas por todo o grupo. Se fosse impossível chegar a um consenso, era envolvido um perito independente.

Tabelas de evidências:

tabelas de evidências foram preenchidas por membros do grupo de trabalho.

Métodos utilizados para formular recomendações:

consenso de especialistas.

Indicadores de boas práticas (Good Prastic Points - GPP):

Análise econômica:

Nenhuma análise de custos foi realizada e as publicações farmacoeconômicas não foram revisadas.

Avaliação de peritos externos;

Avaliação de especialistas internos.

	Descrição
	Pelo menos uma metanálise, revisão sistemática ou ECR com classificação 1++, diretamente aplicável à população-alvo e demonstrando robustez dos resultados, ou conjunto de evidências que inclui resultados de estudos classificados como 1+, diretamente aplicáveis ​​à população-alvo e demonstrando robustez geral dos resultados
	um conjunto de evidências que consiste em resultados de estudos classificados como 2++, diretamente aplicáveis ​​à população-alvo e demonstrando robustez geral dos resultados, ou evidências extrapoladas de estudos classificados como 1++ ou 1+
	um conjunto de evidências que consiste em resultados de estudos classificados como 2+, diretamente aplicáveis ​​à população-alvo e que demonstram a robustez geral dos resultados; ou evidências extrapoladas de estudos classificados como 2++
	Evidência de nível 3 ou 4; ou evidências extrapoladas de estudos classificados como 2+

Estes projetos de recomendações foram revistos por especialistas independentes, aos quais foi pedido que comentassem principalmente sobre até que ponto a interpretação das evidências subjacentes às recomendações era clara.

Foram recebidos comentários de médicos de cuidados primários e terapeutas locais sobre a clareza das recomendações e a sua avaliação da importância das recomendações como ferramenta de trabalho na prática diária.

Uma versão preliminar também foi enviada a um revisor não médico para comentários da perspectiva do paciente.